Teknik Visualisasi pada Sel

Komentator bola akan mengatakan bahwa “Anda dapat mengamati banyak hal dengan menonton”. Hal tersebut sangat sesuai dengan ilmu biologi, karena banyak hal dalam biologi telah ditemukan hanya dengan mengamati isi sel atau mengamati peristiwa yang terjadi pada tingkat molekuler. Anda masih ingat dengan Robert Hooke yang menemukan sel bahkan hanya dengan mengamati sel yang sudah mati. Kemampuan untuk memvisualisasikan dan melihat apa yang terjadi di dalam sel dan pada tingkat molekuler sangat penting untuk proses penemuan hal baru dalam kajian biologi. Tulisan ini akan menjelaskan tentang berbagai alat, baik alat yang sudah digunakan sangat lama, maupun alat terbaru dan canggih, yang digunakan oleh para peneliti biologi untuk mengamati peristiwa apa yang terjadi pada sel hidup maupun mengamati kehidupan sel secara umum.

Cahaya dan ukuran dari sel merupakan kunci untuk melihat komponen ini dan mengamatinya dengan jelas. Dengan cahaya yang tepat, kita dapat membedakan objek tertentu di dalam sampel yang diamati. Untuk dapat membedakan setiap objek pada sampel yang diamati, dibutuhkan alat untuk mengatur resolusi dari gambar yang ditampilkan. Resolusi akan menampilkan perbedaan struktur pada sampel yang sedang diamati. Setelah resolusi, kita membutuhkan kontras untuk dapat membedakan sampel dengan latar belakangnya. Selain itu, sampel yang diamati juga harus baik, melalui proses yang tepat, sehingga gambar yang ditampilkan dapat baik juga. Di akhir, kita membutuhkan alat untuk mengamati semua itu. Alat yang dapat memenuhi seluruh syarat tersebut adalah mikroskop, yaitu kumpulan lensa yang memungkinkan kita dapat mengamati sesuatu dengan jelas.

Mata manusia masih dapat mengamati objek dengan ukuran sekitar 100-200 mikron, tetapi sel dengan ukuran yang lebih kecil akan sulit terlihat dengan mata secara langsung, sehingga dibutuhkan instrumen yang memungkinkan kita melihat hal-hal yang lebih kecil dari batas resolusi mata manusia. Salah satu cara yang dapat digunakan adalah menggunakan mikroskop cahaya, dimana instrumen ini memanfaatkan cahaya tampak untuk mengamati sampel. Saat ini telah banyak gambar yang dihasilkan berasal dari visualisasi yang dihasilkan dari mikroskop cahaya. Untuk mengamati benda yang lebih kecil lagi, mikroskop yang mungkin dapat digunakan adalah mikroskop elektron. Mikroskop elektron memungkinkan kita untuk mengamati struktur sampai tingkat resolusi sub nanometer. Hambatan utama dalam pengamatan sampel menggunakan mikroskop eletron adalah preparat harus dipreparasi dengan benar, sehingga sedikit saja kesalahan akan menimbulkan visualisasi yang kurang jelas.

Gambar 1. Mikroskop Cahaya

Jadi, apa yang menentukan resolusi mikroskop? Pertama-tama, kita akan menentukan terlebih dahulu ukuran resolusi yang disebut dengan D-min (minimun distance) yang menjadi jarak minimun diatara dua titik. Resolusi adalah batas kemampuan mikroskop untuk dapat melihat dengan jelas objek yang diamati. Jika jarak minimum adalah 200 nm, maka jika dua titik lebih besar dari 200 nm maka objek akan terlihat terpisah antara satu dengan yang lainnya, tetapi apabila jarak dua poin lebih dekat dari 200 nm, maka kita akan menemukan dua objek yang sangat berdekatan dan tampak tumpang tindih. Umumnya, d-min yang terdapat pada mikroskop cahaya adalah 200 nm. Pada prosesnya, cahaya akan mengenai sampel dan lensa objektif akan mengumpulkan kerucut cahaya yang masuk ke lensa ini. Lensa objektif akan menangkan cahaya dari berbagai sudut cahaya yang berbeda yang berasal dari spesimen. Yang menentukan batas resolusi adalah panjang gelombang cahaya yang digunakan. Kita dapat menggunakan cahaya berwarna putih dengan panjang gelombang sekitar 400 hingga 800. Jika menggunakan cahaya GFP (Green fluorescent proteins), maka cahaya akan mengeksitasi dengan panjang gelombang 488 nanometer, lebih tepatnya antara 450 hingga 550 nanometer pada berbagai protein fluoresense. Penambahan minyak imersi pada pengamatan sampel menggunakan mikroskop dapat meningkatkan resolusi objek yang diamati.

Gambar 2. Jarak antara dua point pada objek pengamatan

Gambar 3. Jarak pandang mata dan mikroskop pada berbagai objek

Pada dasarnya, semakin banyak cahaya, semakin bayak sudut yang masuk, semakin banyak cahaya yang dikumpulkan, dan semakin tinggi nilai Aperture Numeric (Numerical Aperture merupakan parameter yang merepresentasikan sudut penerimaan maksimum dimana berkas cahaya masih bisa diterima dan merambat didalam objek). Sehingga semakin rendah d-min maka semakin besar kemungkinan objek yang diamati saling berdekatan. D-min adalah panjang gelombang cahaya yang digunakan, dibagi dua kali Aperture Numeric, sehingga umumnya menghasilkan d-min 200 nm. Resolusi ini pada dasarnya dibatasi oleh difraksi. Umumnya sangat sulit untuk menembus batas 200 nm, tetapi faktanya terdapat beberapa orang yang mampu menemukan cara untuk menembus batas tersebut.

Sekarang kita akan berbicara terkait dengan batasan dari penggunaan instrumen mikroskop. Berdasarkan gambar mikrograf elektron retikulum endoplasma pada gambar, pertimbangan yang penting dalam analisis ini adalah struktur dua dimensi versus tiga dimensi yang dihasilkan. Pada penggunaan mikroskop elektron pada dasarnya kita memotong sampel hingga memiliki irisan yang sangat tipis. Proses ini seperti mengiris roti kecuali irisan itu memiliki ketebalan sekitar 30 sampai 60 nanometer. Ketebalan tersebut digunakan untuk sampel yang akan diamati menggunakan mikroskop elektron. Pada pengamatan, kita melewatkan berkas elektron melalui sampel yang telah diberi pewarna untuk memvisualisasikan sampel. Satu kali pengambilan gambar tidak akan memberikan gambaran tiga dimensi terhadap struktur retikulum endoplasma. Peneliti mengambil berbagai gambar dari berbagai sudut sehingga dapat merekontrusksi struktur tiga dimensi dari retikulum endoplasma, sehingga retikulum endoplasma tidak seperti tumpukan lumen, tetapi lebih seperti struktur helikoid dengan berbagai tumpukan dan lilitan membran. Sehingga, pada berbagai jenis sel, struktur retikulum endoplasma seperti garansi parkir yang mana ribosom tersusun seperti mobil yang terparkir.

Gambar 4. Analisis struktur 3 dimensi Retikulum Endoplasma menggunakan Mikroskop Elektron

Selain mikroskop eletron, ada teknik yang melibatkan mikroskop cahaya yang melibatkan pemotongan optik. Jika kita melihat fluoresensi, kita akan menarik seluruh volume sampel sehingga fluoresensi dari luar bidang fokus akan masuk ke dalam visualisasi. Hal ini menyebabkan gambaran yang lebih kabur dan tidak jelas. Tetapi ada teknik, seperti fluoresensi confocal yang memungkinkan kita untuk mengecualikan cahaya yang tidak fokus sehingga dapat memberikan gambaran yang jauh lebih bersih dan lebih baik.

Dalam mikroskop medan terang, pada dasarnya melibatkan cahaya putih sebagai sumber cahaya. Pada mikroskop medan terang, cahaya menyinari sampel tetapi tidak melewati sampel langsung menuju detektor, tetapi sebagian dari cahaya ini akan dibiaskan oleh sampel. Pembiasan cahaya inilah yang menghasilkan kontras untuk mikroskop medan terang. Sehingga struktur asli dari sel akan membiaskan cahaya yang kemudian memunculkan kontras. Tanpa menggunakan pewarna berfluoresensi, kita dapat melihat sebagian besar tampilan sel dan dapat juga melihat tampilan organel atau strukturnya dengan memanfaatkan kontras. Kontras dari spesimen juga dapat ditingkatkan dengan menambahan pewarna. Pada mikroskop elektron, kontras dapat ditingkatkan dengan menambahkan pewarna padat elektron yang akan membengkokkan cahaya elektron sehingga memungkinkan akan memvisualisasikan gambar pada mikroskop elektron. Pewarna padat elektron ini dapat berupa uranil asetat atau beberapa jenis pewarna lainnya.

Mikroskop fluoresensi, melibatkan pengambilan molekul fluoresensi dan menempelkannya pada protein tertentu yang ingin diamati sehingga kita dapat memperoleh kontras untuk protein khusus tersebut. Kontras dari mikroskop fluoresensi berasal dari cahaya dengan panjang gelombang tertentu dan dapat difilter untuk memilih salah satunya yang nanti akan diteruskan untuk menyinari spesimen sampel. Cahaya tersebut kemudian diserap oleh fluorofor dari pewarna fluoresensi. Cara ini sangat efisien untuk menghasilkan kontras karena kita dapat menggunakan filter untuk memilih panjang gelombang cahaya yang dipancarkan dari molekul fluoresensi sampel pengamatan.

Gambar 5. Sistem Mikroskop Fluoresensi