Pengenalan Peralatan Umum yang Dibutuhkan pada Laboratorium Mikroteknik

Laboratorium mikroteknik merupakan laboratorium yang berfungsi untuk pembuatan preparat atau sediaan histologi. Laboratorium mikroteknik dilengkapi dengan berbagai macam alat dan bahan yang dapat digunakan untuk keperluan laboratorium khususnya dalam proses pembuatan sediaan preparat mikroskopis. Selain dilengkapi dengan peralatan yang digunakan untuk bekerja dalam proses pembuatan preparat, laboratorium mikroteknik juga dilengkapi dengan berbagai macam bahan kimia penting dalam proses pembuatan preparat.

“Pada pertemuan kali ini kita akan mengkaji tentang peralatan dasar yang digunakan dalam analisis mikroteknik”

Jika anda pernah bertemu analis mikroteknik, anda akan mendapati bahwa mereka suka menghabiskan waktu berjam-jam hanya untuk duduk di sebuah ruangan kecil dan sedikit gelap (mungkin remang-remang dalam konotasi positif) untuk dapat mengamati berbagai macam sel maupun jaringan melalui preparat. Hal ini terlihat aneh, tapi sesungguhnya ciptaan TUHAN yang satu ini sangatlah indah dengan berbagai bentuk dan ukurannya. Salah satu contoh gambar favorit saya adalah gambar sebuah sel dengan pewarnaan Fluoroscence (nanti belajar tentang ini) sehingga dapat melihat organel mitokondria. Contohnya seperti gambar dibawah ini.

Gambar diatas bukanlah gambar yang diambil menggunakan mikroskop cahaya biasa. Gambar tersebut merupakan gambar dengan menggunakan mikroskop fluorescent dengan sel yang telah diwarnai dengan label khusus sehingga terlihat bercahaya. Kompeksitas dan keindahan seluler seperti ini sebenarnya ada di sekitar kita. Kita hanya memerlukan mikroskop untuk dapat melihatnya dan kemudian menghargai ciptaan Tuhan tersebut.

Salah satu alat yang paling penting dalam analisis mikroteknik adalah MIKROSKOP. Meskipun menggunakan pewarnaan spesifik dalam proses pembuatan preparat histologi, tetap saja jaringan secara detail tidak akan dapat diamati secara langsung menggunakan mata. Mikroskop menjadi alat yang paling penting dalam tujuan melihat jaringan secara detail. Ada beberapa mikroskop yang umum digunakan dalam proses pengamatan preparat histologi di Laboratorium.

Mikroskop Cahaya

Kebanyakan mikroskop yang digunakan oleh mahasiswa di laboratorium adalah mikroskop cahaya. Pada proses pengamatan menggunakan mikroskop cahaya, cahaya akan melewati spesimen (preparat histologis) dan diteruskan melalui suatu sistem lensa sehingga memungkinkan pengguna (user) dapat melihat gambar tersebut dalam kondisi diperbesar. Mikroskop cahaya juga dapat digunakan untuk mengamati sel-sel hidup (terutama organisme bersel satu) sehingga dapat digunakan untuk mengamati perilaku normal organisme tersebut.

Umumnya mahasiswa cenderung menggunakan mikroskop fase terang, yang berarti cahaya tampak melewati sampel yang diamati untuk membentuk gambar secara langsung tanpa modifikasi apapun. Mikroskop cahaya terbaru telah dilengkapi dengan berbagai instrumen yang canggih seperti meningkatkan kontras, membuat bentuk sel menjadi lebih detail, dan mempermudah tampilan jaringan yang diamati.

Mikroskop Fluroscence

Mikroskop fluroscence digunakan untuk mengamati sampel preparat yang dilengkapi dengan pewarna fluroscence yang akan berpendar (mampu menyerap satu panjang gelombang cahaya dan memancarkannya). Dalam banyak kasus, bagian sel atau jaringan yang kia amati, tidak secara alami berpendar dan sebaliknya bagian sel atau jaringan tersebut harus diberi pewarna fluoresence sebelum diamati dibawah mikroskop.

Pada tanggal 8 Oktober 2017, Hadiah Nobel dalam bidang kimia diberikan kepada Eric Betzig William Moerner dan Stefan Hell untuk penemuan mereka dalam bidang mikroskop yang diberi nama “Super-resolved fluorescence microscopy” yang telah membawa dunia pengamatan preparat histologi ke dalam dimensi yang lebih kecil yaitu dimensi nano dengan mikroskop yang dikembangkannya.

Mikroskop Konfokal (confocal microscope)

Mikroskop konfokal (confocal microscope) merupakan mikroskop yang menggunakan sinar laser dan sinar merkuri untuk mendapatkan kualitas yang baik. Mikroskop jenis ini dihubungkan dengan komputer untuk mendapatkan gambar tiga dimensi (3D) dari masing-masing potongan spesimen sesuai dengan tujuan pengamatan. Mikroskop konfokal saat ini banyak digunakan dalam penelitian biologi seluler.

Mikroskop konfokal mampu menangkap citra sebagian (optical sectioning) dari jaringan hidup. Alat ini mampu menangkap citra dari bagian tipis dari jaringan dengan resolusi yang tinggi dan kontras tanpa merusak jaringan secara fisik. Tandem Scanning Confocal Microscope (TSCM) menggunakan lampu merkuri untuk menangkap citra gambar sedangkan Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) menggunakan laser dengan memanfaatkan panjang gelombang tertentu yang lebih selektif dengan daya iluminasi yang tinggi. Mikroskop CLSM lebih banyak digunakan dalam penelitian pengamatan preparat histologi.

CLSM mampu menghilangkan background pada citra gambar disebabkan karena kehilangan fokus dan bias. Teknik konfokal mampu meningkatkan resolusi dari citra mikroskop cahaya diatas yang bisa dicapai oleh mikroskop fluroscence. Pada setiap mikroskop konfokal konsep penangkapan citra dilakukan dengan cara menggabungkan dua hal secara simultan, melakukan scan gambar dengan memberikan iluminasi pada bagian tertentu. CLSM banyak digunakan dalam proses penangkapan gambar dalam bidang biomaterial ataupun bioproduk.

Mikroskop Elektron

Beberapa jenis mikroskop cahaya terkini dapat menghasilkan gambar dengan resolusi yang sangat tinggi. Namun juka anda ingin melihat sesuatu yang sangat kecil para resolusi yang sangat tinggi, anda harus menggunakan teknik yang berbeda. Penggunaan mikroskop elektron merupakan solusi yang tepat dalam pengamatan komponen yang kecil dalam jaringan dengan resolusi yang sangat tinggi.

Mikroskop elektron sangat berbeda dengan mikroskop cahaya karena gambar spesimen yang dihasilkan merupakan gambar dari hasil pantulan elektron yang digunakan pada mikroskop elektron ini. Elektron memiliki panjang gelombang yang jauh lebih pendek dari pada cahaya yang tampak dan ini menyebabkan mikroskop elektron mampu menghasilkan gambar dengan resolusi yang lebih tinggi dari pada mikroskop cahaya standar. Mikroskop elektron tidak hanya dapat mengamati seluruh komponen sel, tetapi juga seluruh subseluler, organel, maupun kompartemen di dalamnya. Keterbatasan dari mikroskop ini adalah, sampel tidak dapat diamati dalam keadaan hidup karena sampel akan ditempatkan pada ruang vakum pada mikroskop elektron dengan proses fiksasi yang sangat ketat.

Gambar diatas merupakan bakteri Salmonella yang diamati menggunakan mikroskop cahaya (kiri) dan mikroskop elektron (kanan). Pada mikroskop cahaya, bakteri hanya terlihat seperti titik-titik ungu kecil pada permukaan preparat sedangkan menggunakan mikroskop elektron anda dapat melihat dengan jelas bentk dan tekstur permukaannya serta detail sel manusia yang sedang ditempati oleh bakteri tersebut.

Terdapat dua jenis utama mikroskop elektron yaitu Scanning Electron Microscopy (SEM) dan Transmission Electron Microscopy (TEM). SEM menggunakan seberkas elektron bolak-balik yang melintasi permukaan sel atau jaringan sehingga memunculkan gambar yang cukup rinci dengan menampilkan hasil gambar 3D. Jenis mikroskop elektron ini yang digunakan untuk mengambil gambar bakteri Salmonella diatas. Pada pengamatan menggunakan TEM, sampel dipotong menjadi irisan yang sangat tipis sebelum diambil gambarnya dengan sinar elektron yang melewati irisan tersebut. TEM sering digunanakan untuk menghasilkan gambar terperinci dari struktur internal sel.

Mikroskop elektron secara signifikan lebih besar dan lebih mahal dari pada mikroskop cahaya standar dan tidak menjadi hal yang mengejutkan mengingat partikel subaton yang harus mereka gunakan disetiap pengamatan.

Perbedaan antara SEM dan TEM dapat anda lihat pada link berikut ini. [Link]

Alat yang tidak kalah penting dibandingkan dengan mikroskop adalah MIKROTOM. Mikrotom adalah instrumen mekanik yang digunakan untuk memotong spesimen jaringan menjadi lembaran yang sangat tipis untuk pemeriksaan mikroskopis, biasanya tebalnya hanya 4-5 micrometer. Biasanya, spesimen jaringan yang mau dipotong ditanam dalam blok parafin sehingga dapat dipegang oleh mesin microtom untuk proses pemotongan. Terdapat beberapa jenis mikrotom yang umum digunakan, tergantung dari tujuan penelitian. Mikrotom tersebut antara lain:

Rotary Microtome

Mikrotom yang digunakan untuk memotong sampel yang akan terlihat dibawah mikroskop cahaya. Biasanya dioperasikan secara manual dengan memutar handel hingga mendekati mata pisau. Rotary microtome dapat memotong sampel yang keras (biasanya sampel jaringan dilapisi parafin). Ketebalan yang dihasilkan antara 0,5 um hingga 60 um. Disebut dengan nama The rotary microtome karena penggunaannya dengan cara diputar. Mikrotom jenis ini adalah yang paling sering digunakan dalam berbagai penelitian dasar. Pergerakan pisau pemotong secara vertikal. Biasanya menggunakan tipe wedge knife. Tingkat ketebalan ditentukan oleh micrometer screws. Mikrotom jenis ini membutuhkan bantuan parafin sebagai pelapis sampel agar tidak rusak pada saat dipotong.

Tipe mikrotom yang paling tua. Namanya didasarkan dari cara penggunaan handel mikrotom secara mengayun (rocking action of the handle). Metode pemotongan menghasilkan bagian dari permukaan sedikit silinder. Efektif untuk memproduksi serangkaian berkualitas baik 6-20 mikron. Mikrotom ini tidak dapat memotong sampel yang keras seperti kayu atau tulang. Menggunakan pisau biconcave yang sangat tajam namun juga mudah tumpul.

Rocking Microtome

Sledge Microtome

Merupakan mikrotom yang digunakan untuk memotong sampel yang lebar dan dapat digunakan untuk sampel kasar seperti kayu dan tulang. Digunakan untuk memotong blok parafin yang besar seperti sampel: bola mata, otak, paru-paru dan jaringan yang keras. Mikrotom ini ukurannya cukup besar dan berat. Jenis pisau yang digunakan adalah wedge atau planar. Ketebalan potongan dapat diatur melalui micrometer yang ada di bagian bawah.

Ultra Microtome

Ultra mikrotom adalah alat yang digunakan untuk memotong sampel dengan metode ultramicrotomy. Metode ini adalah cara memotong yang sangat tipis dan disiapkan untuk pengamatan pada mikroskop elektron. Ketebalan blok parafin yang dapat digunakan tidak lebih dari 0,7 mm. Jenis pisau yang digunakan adalah diamond knives.

Freezing Microtome

Sering digunakan untuk penyayatan jaringan yang tidak ditanam dalam paraffin maupun dalam celloidin, jadi jaringan yang disayat adalah jaringan yang tidak di tanam tetapi dibekukan dengan memakai gas CO2. Keuntungan dari mikrotom ini adalah waktu yang dipakai lebih pendek, karena langsung disayat setelah proses fiksasi. Kerugiannya adalah bila temperature kamar tinggi, objek menjadi lunak sehingga sulit dipotong.

Selain Mikrotom dan Mikroskop, terdapat peralatan laboratorium lain yang tidak kalah penting dengan kedua peralatan tadi.

Tissue Processing Automatic

Tissue Processing Automatic adalah alat yang digunakan untuk menjalankan proses tissue processing secara otomatis. Alat tersebut dapat menjalankan proses perendaman untuk langkah-langkah tissue processing seperti dehidrasi, clearing, dan infiltration secara otomatis lengkap dengan waktu serta pilihan reagen yang telah ditetapkan. Tujuan akhir tissue processing adalah memperoleh jaringan yang siap untuk di sectioning menggunakan mikrotom.

Automatic Slide Stainer

Automatic Slide Stainer memiliki fungsi mirip dengan Tissue Processing Automatic. Automatic Slide Stainer mewarnai slide dengan cara otomatis menggunakan sebuah mesin yang dapat diatur tata letak perendaman preparat terhadap pewarna tertentu.

Alat Bedah Hewan

Alat bedah hewan digunakan untuk proses pengambilan jaringan dari tubuh hewan. Alat bedah menjadi bagian penting dalam proses pembuatan preparat histologis karena pengambilan jaringan dari tubuh hewan harus melalui prosedur standar agar jaringan tidak rusak.

Baki Slide (tissue cassette)

Baki Slide adalah baki yang digunakan sebagai tempat penyimpanan jaringan selama proses pembuatan preparat histologi. Baik jaringan hewan maupun jaringan tumbuhan, proses pembuatan preparat histologi sebagian besar menggunakan baki slide.

Oven

Oven pada proses pembuatan preparat histologi digunakan untuk proses pemanasan lilin parafin. Parafin yang meleleh pada suhu tertentu, akan meleleh pada oven dengan suhu yang telah diatur sesuai titik leleh parafin.

Cetakan Baki Slide (Embedding Tissue Cassette Mold)

Cetakan baki slide digunakan dalam proses penanaman sampel dalam parafin lilin pada tahapan embedding. Cetakan baki slide biasanya memiliki ukuran bak cetakan yang bervariasi tergantung dari ukuran jaringan yang akan dibuat preparat. Cetakan baki slide dapat terbuat dari aluminium maupun dari plastik kaca tebal.

Embedding Center

Embedding center merupakan alat yang dapat digunakan untuk proses embedding pada tahapan pembuatan preparat histologi. Embedding center dilengkapi dengan Wax dispenser (pemanas lilin parafin dan akan mengeluarkan lilin parafin cair seperti kerja dispenser), wadah baki slide dan cetakan baki slide, serta pendingin.

Bak Pengapung Jaringan (Paraffin Section Mounting Bath)

Bak pengapung jaringan digunakan untuk mengapungkan pita parafin hasil sectioning agar tidak rusak. Umumnya bak pengapung jaringan memiliki suhu 5-6 derajat dibawah titik leleh parafin yang digunakan.

Laboratorium Standar

Pada pembuatan preparat histologi, laboratorium standar menjadi syarat utama yang menentukan keberhasilan pembuatan preparat. Laboratorium standar pembuatan preparat mikroteknik mencakup kestabilan suhu diruangan laboratorium. Suhu mencakup 20-25 derajat celcius agar pada proses pengerjaan, jaringan tidak rusak. Tata letak peralatan hingga kalibrasi peralatan sangat penting bagi keberhasilan proses pembuatan preparat. (materi pada bagian ini include pada tugas CBR)