Teknik Southern Blotting untuk Deteksi DNA

Setelah dikembangkannya Elektroforesis Gel yang mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran dan muatannya, maka teknik untuk mendeteksi DNA spesifik juga berhasil dikembangkan. Salah satu teknik deteksi DNA spesifik yang pernah dikembangkan yaitu : Southern Blotting. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Edwin Southern pada tahun 1975 [1]. Southern Blotting bertujuan untuk mendeteksi dan menganalisis fragmen DNA (gen) spesifik yang terdapat di dalam genom. Walaupun saat ini sudah berkembang metode untuk deteksi fragmen DNA (seperti : PCR atau Sekuensing), Southern Blotting ini masih tetap relevan digunakan, terutama dalam memvalidasi ataupun mengkonfirmasi gen spesifik [2]. Teknik ini kemudian memunculkan teknik-teknik baru Northern Blotting (untuk analisis RNA spesifik) dan Western Blotting (untuk analisis protein spesifik) [3].

Gambar 1. Perbedaan Visualisasi Hasil Elektroforesis dari Keseluruhan Genom dengan hasil Southern Blotting (Terlihat Tragmen DNA Spesifik yang Terpisah).

Diadaptasi dari : (Snustad & Simons, 2012)

Prinsip Dasar Southern Blot

Pada dasarnya teknik Southern Blotting ini dilakukan dengan memisahkan fragmen DNA melalui elektroforesis dan kemudian dihibridasi dengan Probe (untaian DNA pendek berlabel) di dalam membran (Nilon atau Nitraselulosa) [4]. Fragmen DNA yang telah terpisah akan didenaturasi terlebih dahulu untuk memisahkan untaian ganda menjadi untaian tunggal. DNA yang telah didenaturasi, kemudian akan dihibridisasi dengan Probe. Apabila urutan basa pada Probe tersebut menemukan basa komplementernya, maka Probe dapat menempel dengan DNA target dan label yang dibawa Probe tersebut akan menghasilkan sinyal, sehingga membentuk pola pita yang dapat dianalisis [3].

Gambar 2. Prinsip Kerja Teknik Southern Blot menghasilkan Pola Pita yang spesifik

Prosedur Singkat Teknik Southern Blotting

Restriksi DNA dan Elektroforesis

FragmenDNA dipotong dari genom dengan menambahkan enzim restriksi ke dalam larutan DNA di dalam Microcentrifuge Tube, kemudian diinkubasi semalaman di suhu 37℃ (untuk mengaktifkan enzim restriksi).  DNA yang sudah dipotong kemudian dilakukan elektroforesis dengan ketebalan gel ≤7 mm untuk memisahkan fragmen DNA target. Untuk mengetahui ukuran fragmen DNA masukkan DNA Marker. Ukuran fragmen DNA tersebut penting sebagai dasar penenutuan posisi Probe untuk menempel saat Hibridisasi. Gel direndam di dalam larutan Ethidium Bromide agar dapat diamati dengan sinar UV [5].

Gambar 3. Restriksi DNA dan Elektroforesis untuk Memisahkan Fragmen DNA

Denaturasi DNA

Sebelumnya gel agarosa hasil elektroforesis direndam di Aquadest terlebih dahulu, hal tersebut bertujuan untuk menghilangkan sisa-sisa bahan kimia yang digunakan sebelumnya (Washing). Denaturasi dilakukan dengan merendam gel agarosa ke dalam larutan denaturasi, yaitu NaOH. Aduk perlahan gel agarosa didalam rendaman NaOH selama ≤ 20 menit [5]. Denaturasi bertujuan untuk membuka untai ganda DNA menjadi untai tunggal, sehingga Probe dapat menempel pada saat proses Hibridisasi nantinya [6].  

”Analoginya seperti merendam resleting baju  di dalam larutan kimia hingga terbuka“

Transfer DNA ke Membran (Blotting)

DNA yang sudah didenaturasi dipindahkan dari gel agarosa ke membran (Nilon atau Nitroselulosa) dengan prinsip Kapilaritas, yaitu dengan mengalirkan larutan transfer melalui spons, sehingga fragmen DNA naik ke membran. Langkah ini bertujuan untuk mendapatkan cetakan pola pita yang terbentuk secara permanen. Blotting DNA dapat dilakukan dengan langkah-langkah sebagai berikut [5].

• Letakkan Spons diatas piringan kaca, dan tuang larutan SSC 20x hingga spons terendam sepenuhnya. SSC 20x merupakan buffer garam yang berperan menyediakan lingkungan ionik yang stabil untuk DNA.
• Sebagai alternatif lain, Spons dapat diganti dengan kertas saring Whatmann 33mm yang digulung sebagai sumbu;
• Letakkan 2-3 lembar kertas saring Whatman 33mm diatas spons;
• Letakkan Gel Agarosa diatas kertas saring Whatman 33mm, hilangkan gelembung apabila ada;
• Basahi Membran (Nilon atau Nitroselulosa) dengan SSC 20x dan letakkan diatas Gel Agarosa.
• Proses dan posisi peletakan dari langkah tersebut, dapat dilihat selengkapnya pada Gambar 4.

Gambar 4. Proses Memindahkan DNA dari Gel Agarosa ke Membran (Blotting)

Imobilisasi DNA di dalam Membran

Imobilisasi DNA dilakukan untuk menghentikan pergerakan DNA, sehingga memudahkan Probe menghibridisasi DNA target nantinya [3]. Tahapan ini dilakukan dengan memanggang membran ke dalam Oven dengan suhu 80℃ selama 2 jam [5]. Kemudian untuk Membran Nilon, direkomendasikan memapari Membran dengan sinar UV, letakkan sisi DNA pada Membran menghadap ke bawah di UV-Transiluminator. Hal tersebut bertujuan untuk memperkuat ikatan DNA dengan membran [7].

Penting : Apabila menggunakan Membran Nitroselulosa, pemaparan sinar UV tidak perlu dilakukan

Hibridisasi DNA

 Hibridasi DNA dengan Probe dilakukan di dalam Membran (Nilon atau Nitraselulosa). Probe diberikan label (Radioaktif atau Fluoresens) agar bisa dideteksi. Apabila Probe menemukanurutan yang cocok pada DNA target, maka Probe akan menempel dan Label yang dibawa Probe akan berpendar. Label Probe Radioaktif dapat dideteksi dengan Sinar-X, sedangkan label Probe Fluoresens, dapat dideteksi dengan Gel Doc [8].

Gambar 5. Hibridisasi DNA dengan Probe Berlabel

Penting : Setelah Hibridasi DNA selesai dilakukan, Membran dicuci dengan larutan SSC 20x dan SDS. Hal tersebut bertujuan untuk membersihkan sisa Probe yang tidak menempel, sehingga dapat meningkatkan kualitas hasil deteksi.

Referensi

1. P. Snustad and M. J. Simmons, Principles of Genetics, VI. Jefferson City: John Wiley & Sons, Inc., 2012.
2. J. E. Krebs, E. S. Goldstein, and S. T. Kilpatrick, Lewin’s Genes XII. Pennysilvania: Jones & Bartlett Learning, 2017.
3. E. Arnold, Principle and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology, 7th ed. Cambridge University Press, 2010.
4. A. J. F. Griffiths, S. R. Wessler, S. B. Carroll, and J. Doebley, An introduction to genetic analysis, 11th ed. New York: W. H. Freeman and Company, 2015.
5. T. Brown, ‘Southern Blotting’, Curr. Protoc. Mol. Biol., vol. 21, no. 1, Jan. 1993, doi: 10.1002/0471142727.mb0209as21.
6. M. R. Green and J. Sambrook, ‘Analysis of DNA by southern blotting’, Cold Spring Harb. Protoc., vol. 6, no. 7, pp. 251–256, 2021, doi: 10.1101/pdb.top100396.
7. M. A. Mansfield, M. Mabuchi, C. G. MacDonald, and M. G. Pluskal, ‘Immobilon^TM-Ny+ Nucleic Acid Blotting Membrane: An Advanced Nylon Membrane Optimized for Superior Fixation and Reprobing’, Biotechniques, vol. 27, no. 6, pp. 1253–1257, Dec. 1999, doi: 10.2144/99276pf01.
8. Y. Cheng, N. Wang, Z. Ren, and C. Xu, ‘Development of fluorescence-based nucleic acid blot hybridization method using Cy5.5 labeled DNA probes’, J. Microbiol. Methods, vol. 197, p. 106479, Jun. 2022, doi: 10.1016/j.mimet.2022.106479.