Fiksasi

Pada postingan kali ini kita akan belajar terkait dasar-dasar fiksasi jaringan. Selain itu kita juga akan belajar tentang jenis-jenis larutan fiksasi serta keuntungan dan kerugian dalam penggunaan larutan fiksasi tersebut. Hal ini juga terkait dengan beberapa formula larutan fiksasi yang saat ini umum digunakan dalam bidang patologi, histologi, dan anatomi. Fiksasi jaringan merupakan salah satu metode yang umum digunakan dan tepat untuk melakukan pemeriksaan histologis yang merupakan inti dari semua uji histologi. Karena tampak proses ini semua jaringan akan terdegradasi dan analisis tidak akan dapat dilakukan. Penelitian-penelitian terbaru menunjukkan bahwa metode fiksasi telah berkembang dengan banyaknya modifikasi-modifikasi baru terkait dengan larutan fiksatif. Mekanisme dan prinsip kerja fiksatif spesifik terbagi dalam beberapa kelompok besar. Termasuk penambahan gugus kovalen, menggunakan efek asam, pembentukan garam, serta menggunakan panas. Senyawa fiksasi berfungsi dengan menggunakan mekanisme-mekanisme ini. Ketika memilih larutan fiksasi maka seseorang harus mempertimbangkan keseimbangan antara kelebihan dan kekurangan yang dimiliki oleh masing-masing larutan fiksatif. Efek yang mungkin muncul ketika salah dalam memilih larutan fiksatif yaitu Kehilangan jaringan, pembengkakan atau penyusutan jaringan, kualitas pewarnaan sitokimia dan imunohistokimia yang buruk, efek pada analisis biokimia, dan kurangnya kemampuan untuk mempertahankan struktur organel sekunder.

Tujuan utama dari fiksasi dalam bidang patologi adalah untuk mempertahankan ciri morfologi dari jaringan secara jelas dan konsisten. Perkembangan larutan fiksatif yang digunakan dalam metode mikroteknik bersifat empiris atau melibatkan banyak temuan-temuan penting, meskipun banyak pemahaman yang menyatakan bahwa mekanisme fiksasi didasarkan pada informasi yang diperoleh dari proses pengawetan kulit di masa lampau. Untuk dapat memvisualisasikan mikroanatomi dari jaringan yang diamati, kaitan mikroskopis kondisi asli sel, komponen seluler, dan bahan ekstraseluler harus dipertahankan dengan meminimalisir kerusakan pada jaringan tersebut. Selain itu pada pengamatan histokimia maupun imunohistokimia, komposisi kimia pada jaringan juga harus dipertahankan. Banyak komponen jaringan yang dapat larut di dalam larutan asam atau lingkungan yang basah sehingga untuk melihat mikroanatomi jaringan tersebut dibutuhkan metode fiksasi yang handal sehingga komponen yang larut tersebut tidak boleh hilang selama proses fiksasi dan pemrosesan jaringan. Meminimalkan hilangnya komponen seluler yang meliputi protein, mRNA, DNA, dan lipid dapat mencegah penghancuran struktur makromolekul jaringan seperti sitoplasma, retikulum endoplasma, membran nukleus, lisosom, dan mitokondria. Setiap larutan fiksatif atau kombinasi dari berbagai larutan fiksatif, mempertahankan beberapa aspek molekuler dan makro molekul jaringan sehingga kombinasi dari penggunaan beberapa larutan fiksatif yang yang desain dengan baik dapat menghasilkan larutan fiksatif yang lebih baik dalam mempertahankan jaringan dibandingkan dengan larutan fiksatif tunggal. Jika komponen jaringan terlarut hilang dari sitoplasma sel maka warna sitoplasma ketika dilakukan pewarnaan menggunakan hematoksilin dan iodin akan berkurang. Demikian pula pada analisis struktur dan fungsi jaringan histokimia, kegagalan mempertahankan komponen terlarut dapat menyebabkan sulitnya jaringan untuk dianalisis lebih lanjut.

Hampir semua larutan yang digunakan dalam metode fiksasi menyebabkan penyusutan atau pembengkakan serta pengerasan jaringan yang diiringi kerusakan pada variasi warna pada jaringan yang diamati. Berbagai metode fiksasi yang saat ini umum digunakan pada pengamatan histologis, selalu menghasilkan artefak pada jaringan yang telah diwarnai. Namun untuk diagnosa patologi, Pola artefak secara konsisten sangat penting untuk diketahui sehingga dapat diprediksi dan dipahami bahwa artefak tersebut merupakan bagian dari proses fiksasi dan bukan kondisi jaringan yang sebenarnya. Larutan fiksatif yang baik dipilih untuk meminimalkan hilangnya atau hancurnya molekul enzimatik seluler dan ekstraseluler serta mempertahankan struktur makro molekul dan melindungi jaringan dari kerusakan yang disebabkan oleh mikroorganisme selama pemrosesan jaringan. Hal ini memunculkan satu pandangan tentang perubahan dinamis pada jaringan yang layak untuk diamati sebagai bagian dari produk preparat histologis. Larutan fiksatif juga harus mencegah kerusakan jaringan atau fitur molekul lainnya yang disebabkan oleh aktivitas enzimatik maupun mikroorganisme selama proses penyimpanan jangka panjang pasca produksi preparat histologis. Jaringan yang diperoleh dari simple merupakan data penting yang perlu disimpan untuk pengamatan di masa yang akan datang sehingga perlu dijaga konsistensi dan kondisi preparat pasca produksi preparat histologi.

Larutan fiksasi tidak hanya berinteraksi dengan jaringan pada saat pemrosesan jaringan tetapi larutan fiksasi mengambil peran penting pada proses pasca pembuatan preparat jaringan serta penyimpanan jaringan untuk jangka waktu yang panjang. Pada tahapan pemrosesan jaringan, larutan fiksasi mengambil peran penting pada setiap fase pemrosesan jaringan mulai dari proses dehidrasi, pewarnaan, hingga proses mounting. Sampai saat ini belum ada ditemukan fiksatif universal atau fiksatif yang paling ideal untuk jaringan tertentu. Oleh karena itu, larutan fiksatif dipilih berdasarkan kemampuannya untuk menghasilkan produk akhir yang dibutuhkan pada penelitian untuk menunjukkan fitur spesifik dari jaringan tertentu. Pada sebagian besar ahli patologi, larutan fiksatif yang yang umum digunakan adalah menggunakan formalin buffer netral 10% dalam diagnosa patologi.

Kendala yang muncul ketika menggunakan formaldehida pada proses fiksasi adalah hilangnya komponen antigen karena jenis fiksasi ini akan dikombinasikan dengan pemrosesan jaringan menggunakan lilin parafin. Namun dari perspektif klinis, modifikasi dari penggunaan metode ini untuk pengamatan yang menggunakan antigen telah banyak ditemukan, termasuk dengan penggunaan induksi panas yang telah dilakukan sejak tahun 1990. Demikian pula pada pengamatan asam nukleat, metode dengan menggunakan fiksasi formalin dan parafin menjadi masalah utama dalam pengamatan anne-marie molekul ini. Oleh karena itu semua larutan fiksatif yang dipilih merupakan hasil dari analisis dan kompromi dengan mempertimbangkan aspek positif dan negatifnya serta mempertimbangkan fitur-fitur yang diinginkan atau yang tidak diinginkan untuk ditampilkan pada jaringan hasil akhir dari pembuatan preparat.

Karakteristik yang paling penting dari larutan fiksatif adalah jaringan yang dihasilkan harus mendukung atau kompatibel untuk dilakukan pewarnaan, baik menggunakan pewarnaan spesifik maupun pewarnaan yang umum seperti hematoxylin dan eosin. Selain itu dalam pemilihan larutan fiksatif harus mempertimbangkan kondisi jaringan pasca pemrosesan jaringan setidaknya satu dekade sejak preparat itu dibuat, meskipun temuan saat ini menyatakan bahwa metode pembuatan preparat menggunakan blok parafin jika dilakukan secara benar dapat menghasilkan preparat yang dapat disimpan dalam jangka waktu 30 tahun sejak preparat itu dibuat. Larutan fiksatif harus memiliki kemampuan untuk mencegah kerusakan mikro arsitektur jaringan dalam jangka pendek dan jangka panjang dengan cara menghentikan Aktivitas enzim katabolik yang menyebabkan autolisis serta meminimalkan difusi molekul terlarut dari lingkungan masuk ke dalam jaringan. Karakteristik penting lainnya dari larutan fiksatif yaitu mampu menjaga integritas jaringan dan seluler serta melakukan inaktivasi agen penginfeksi.

Munculnya metode biologis baru untuk meningkatkan pemahaman tentang zina manusia serta memenuhi kebutuhan untuk mengevaluasi proses biologis penyakit dengan cepat membawa perkembangan daratan fiksatif kepada larutan yang memungkinkan pemulihan makromolekul termasuk protein, asam nukleat dan makro molekul lainnya dari jaringan tetap serta tertanam dalam parafin. Karakteristik penting lainnya dari larutan fiksatif yang ideal adalah mampu mempertahankan berbagai jenis makromolekul dalam jaringan serta bekerja baik pada berbagai jenis sel dalam jaringan yang sama. Larutan fiksatif harus mampu menembus dan memperbaiki jaringan dengan cepat serta memiliki umur Simpan yang cukup panjang.

Sebagian besar jaringan hewan maupun tumbuhan akan rusak jika dipisahkan dari indukan multiselulernya dikarenakan ketidak mampuan sel untuk mempertahankan bentuk alaminya. Maka, untuk mempertahankan bentuk alaminya, dibutuhkan suatu proses yang disebut dengan fiksasi (to fix) yang artinya menetapkan pada bentuk alamiahnya, dikeraskan dan distabilkan untuk dapat mempertahankan bentuknya selama proses pembuatan preparat.

Tipe Fiksatif

Fiksasi jaringan dapat dilakukan dengan metode fisik maupun kimia. Metode fisik contohnya dalam menggunakan pemanasan dengan microwave dan pengeringan beku. Proses ini merupakan proses independen dan tidak umum digunakan pada praktek rutin patologi medis atau veteriner, anatomi, dan histologi. Pengecualian pada penggunaan fiksasi panas kering mikroorganisme yang dilakukan pada Proses pewarnaan Gram. Sebagian besar metode fiksasi yang digunakan dalam pengawetan jaringan untuk diagnosis histopatologi sangat bergantung pada Larutan fiksatif kimia berupa cairan. Reproduksi bilitas pada tampilan mikroskopis jaringan setelah pewarnaan hematoksilin dan eosin adalah persyaratan Utama larutan fiksatif yang digunakan untuk diagnosa patologis.

Beberapa bahan kimia atau kombinasi dari beberapa bahan kimia yang dapat berfungsi sebagai larutan fiksatif yang baik untuk mencapai tujuan fiksasi yang diinginkan. Beberapa larutan fiksatif menambahkan gugus reaktif kovalen yang dapat menginduksi terjadinya ikatan silang antara protein pada protein yang terdapat pada individu. Contoh terbaik dari larutan ini adalah penggunaan formaldehida dan glutaraldehida. Pendekatan lain yang digunakan untuk pemilihan larutan fiksatif adalah menggunakan agent yang dapat menghilangkan air di dalam jaringan serta mengendapkan dan mengentalkan protein. Contoh dehidran ini termasuk didalamnya etanol metanol dan aseton. Agen ini mendenaturasi protein dengan cara memutus ikatan hidrofobik yang bertanggung jawab terhadap struktur tersier protein. Fixative lainnya yaitu penggunaan asam asetat, asam trikloroasetat, merkuri klorida, dan zinc asetat yang bertindak dalam proses denaturasi protein dan asam nukleat melalui perubahan ph atau melalui pembentukan garam. Fiksatif merupakan gabungan atau campuran dari Regent yang disebut dengan larutan fiksatif majemuk misalnya formalin alkohol yang memperbaiki jaringan dengan dua cara yaitu dengan menambahkan gugus hidroksil kovalen dan protein pengikat silang serta dengan melakukan koagulasi dan dehidrasi.

Kerusakan Jaringan Pasca Kematian

Aktifnya enzim-enzim autolysis yang menyebabkan kerusakan jaringan dengan cara memecah protein menjadi asam amino. Asam amino kemudian keluar dari sel dan tidak dapat digunakan kembali. Hal ini menyebabkan protein structural yang terdapat pada hampir seluruh jaringan akan rusak.

Tujuan Fiksasi

• Menghentikan proses metabolic secara cepat
• Mencegah terjadinya perubahan yang bersifat regresif
• Mengawetkan bahan histologis dan sitologis
• Mempertahankan bentuk actual bahan biologis
• Mengeraskan dan menstabilkan bahan-bahan biologis karena terjadi koagulasi protoplasma
• Memberi kemungkinan adanya perbedaan optic pada proses pengamatan jaringan.

Untuk dapat melakukan fungsi fiksasi, maka proses fiksasi membutuhkan reagen yang disebut dengan larutan fiksatif. Larutan fiksatif merupakan larutan yang menjalankan tugas dengan tujuan fiksasi.

Sifat Larutan Fiksatif

• Memiliki daya penetrasi yang baik ke dalam jaringan
• Dapat menembus jaringan dengan cepat tanpa menyebabkan kerusakan
• Mencegah perubahan jaringan secara cepat
• Memiliki kemampuan koagulasi protoplasma dengan baik
• Tidak merusak jaringan dan isi sel
• Melindungi jaringan selama proses pengerjaan preparat
• Membuat bagian jaringan lebih jelas

Proses fiksasi harus dilakukan sesegera mungkin setelah proses pengambilan jaringan untuk mencegah kerusakan jaringan atau sel sebelum dilakukannya fiksasi. Fiksasi memiliki fungsi menetapkan jaringan, bukan mengembalikan jaringan ke bentuk semula sehingga kerusakan yang diakibatkan sebelum terjadinya fiksasi tidak dapat diperbaiki. Larutan fiksatif idealnya mampu menjalankan fungsi seperti tujuan fiksasi. Namun, fiksasi ideal sangat sulit untuk ditemukan. Setiap larutan fiksatif memiliki kelebihan dan kekurangannya masing-masing.

Kesulitan Penggunaan Larutan Fiksatif

• Fiksatif ideal sangat sulit ditemukan karena jaringan memiliki karakter yang berbeda-beda.
• Dapat mengawetkan sel tertentu tetapi melarutkan bahan sel yang lainnya.
• Bersifat mordant pada jaringan tertentu, tetapi mengganggu proses pewarnaan pada jaringan lain.
• Tidak ada larutan fiksatif tunggal yang ideal, biasanya yang baik, larutan bersifat majemuk.
• Mampu memfiksasi inti sel dengan baik, namun cenderung menggembungkan jaringan (asam asetat).
• Penetrabilitas jaringan yang buruk, daya pengerasan jaringan kurang, daya awet nucleus rendah, tetapi merupakan bahan pengawet dan mordant sitoplasma yang sangat baik (Kalium Dikromat).
• Formalin dan glutaraldehidal merupakan fiksatif yang umum digunakan dalam bentuk larutan tunggal.

Sifat Larutan Fiksatif yang Baik

Fiksatif yang baik biasanya terdiri dari larutan majemuk dengan kemampuan koagulan dan kemampuan nonkoagulan sekaligus. Contohnya larutan campuran antara asam asetat dan kalium dikromat. Koagunan akan mengubah protein menjadi serat halus (menautkan antar protein agar tidak rusak) sehingga paraffin dapat dengan mudah diinfiltrasi sehingga jaringan menjadi lebih stabil pada saat disayat. Nonkoagulan menimbulkan sedikit artifak, tetapi jika digunakan tunggal dapat menimbulkan inkonsistensi pada jaringan sehingga mengganggun proses infiltrasi dan embedding.

Memilih Larutan Fiksatif

• Jenis dan tujuan pengamatan yang akan dilakukan
• Jenis sel atau jaringan yang akan difiksasi
• Memahami efek negative dan positif dari setiap larutan fiksatif
• Memahami jenis larutan fiksatif yang digunakan untuk keperluan umum dan khusus.

Keuntungan dan Kerugian Larutan Fiksatif (Studi Kasus Larutan Bouin)

Larutan Fiksatif	Keuntungan	Kerugian
Formaldehida	Mampu memfiksasi sitoplasma dengan baik	Menghambat penetrasi paraffin dalam jaringan; Fiksasi kromatin yang buruk
Asam Pikrat	Koagulasi sitoplasma yang baik dan asidofilik, memudahkan paraffin untuk penetrasi, jaringan tetap lembut dan stabil, mampu memfiksasi kromatin	Mengerutkan jaringan dan membuat kromatin menjadi asidofilik
Asam Asetat	Mengurangi pengerutan jaringan, inti, dan sitoplasma	Melarutkan sel

Larutan fiksatif umum dan tujuannya

Tujuan Penggunaan Larutan Fiksatif	Jenis Larutan Fiksatif
Tujuan pengamatan masih belum jelas	Formalin
Anatomi komponen sel secara sederhana	Formalin, Comori, Zenker, Helly, atau Bouin
Pengamatan inklusi sel secara khusus	Carnoy, Flemming, Champy, Helly, Schaudinn atau Regaud
Pengamatan histokimia	Aldehida, Aseton, atau Etanol

Fiksatif Tunggal

• Asam asetat
• Aseton
• Kromium Trioksida
• Alkohol
• Aldehida/Formalin
• Merkuri Klorida
• Osmium tetroksida
• Asam pikrat
• Kalium dikromat
• Asam trikloroasetat
• Natrium sulfat

Fiksatif Majemuk

Fiksatif Campuran	Komponen
Larutan Mueller	Kalium dikromat 2,5 atau 3 gram Natrium sulfat 1 gram Aquades 100 ml
Larutan Orth	Kalium dikromat 2,5 gram Natrium sulfat 1 gram Aquades 90 ml Formalin 10 ml
Larutan zenker	Kalium dikromat 2,5 gram Merkuri klorida 5 gram Natrium sulfat 1 gram Aquadest 100 ml
Larutan Helly	Larutan Zenker 10 ml Formalin komersial 1 ml
Larutan Heidenhain	Kalium dikromat 1,8 gram Merkuri klorida 4.5 gram Asam asetat glasial 4,5 ml Formalin komersial 10 ml Aquades 90 ml
Larutan Lavdowsky	Kalium dikromat 5 gram Merkuri klorida 0,15 gram Asam asetat glasial 2 ml Akuades 100 ml
Larutan Mann	H2O panas 100 ml Merkuri Klorida 2,5 gram Asam pikrat 1 gram
Larutan bouin	Asam pikrat jenuh 75 ml Formalin komersial 20 ml Asam asetat glasial 5 ml
Larutan allen B	Kristal asam kromat 1,5 gram Kristal urea 2 gram
Larutan Gilson	Merkuri klorida 20 bagian Asam kromat 1% 20 bagian Asam nitrat 2 bagian Asam asetat glasial 2 bagian
Larutan Bensey AOB	Asam osmat 2% 2 ml Kalium dikromat 2,5% 8 ml Asam asetat glasial 1 tetes
Larutan regaud	Kalium dikromat 3% 80 ml Formalin komersial 20 ml
Larutan Bianco	Asam kromat 1 gram Asam asetat glasial 5 ml Aquadest 100 ml
Larutan Gate	Asam kromat 0,7 gram Asam asetat glasial 0,5 ml Aquadest 100 ml
Larutan Navashin	Asam kromat 0,8 gram Asam asetat glasial 20 ml Formalin komersial 5 ml Aquadest 100 ml
Larutan carnoy	Alkohol Absolut 60 ml Kloroform 30 ml Asam asetat glasial 10 ml
Larutan AFA (Alkohol Formalin Asetat)	Etanol 70% 90 ml Formalin komersial 10 ml Asam asetat glasial 2 ml
Larutan kormer	Kalium dikromat 1,8 gram Uranil asetat 0,75 gram Formalin komersial 3,6 ml Asam asetat glasial 9 ml Asam trikloroasetat 4,8 ml Aquadest 87 ml
Larutan Petrunkewitsch A	Asam nitrat 12 ml Nitrat dari cuprum 8 gram Aquadest 100 ml
Larutan Petrunkewitsch B	Phenol 4 gram Etil eter 6 gram Etanol 80%

Pertimbangan Penggunaan Larutan Fiksatif

• Memperhatikan tujuan pengamatan dalam pembuatan preparat histologi
• Efek pengerasan jaringan yang ditimbulkan oleh larutan fiksatif
• Volume larutan fiksatif yang digunakan
• Waktu perendaman jaringan menggunakan larutan fiksatif

Perlakuan Sebelum Fiksasi

Jika jaringan terlalu padat seperti jaringan otot atau lainnya, maka perlu diberikan perlakuan sebelumnya untuk proses disosiasi selama fiksasi. Larutan maserasi bukanlah larutan fiksatif, sehingga setelah proses maserasi, larutan harus segera dimasukkan ke dalam larutan fiksasi kembali.

Fiksasi Selain Menggunakan Perendaman

Fiksasi dengan cara perfusi.Memaksa larutan fiksatif masuk ke dalam jaringan menggunakan alat. Biasanya digunakan untuk pengawetan hewan yang baru mati atau hewan yang masih hidup tetapi dibawah pengaruh anestesi. Fiksasi ini untuk jaringan yang harus segera difiksasi tetapi tidak dapat diambil dengan cepat. Contoh jaringan: Sistem saraf, Contoh alat: Canulla glass

Hewan difiksasi segera dengan cara perfusi sebelum organnya dikoleksi untuk menghindari kerusakan organ tersebut.

—- Perfusi —-