Pengantar Next Generation Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) merupakan platform yang memungkinkan pembacaan urutan ribuan hingga jutaan molekul DNA secara bersamaan. Alat ini telah merevolusi bidang-bidang seperti obat-obatan, penyakit genetik, dan diagnostik klinis dengan menawarkan opsi yang lebih baik, input data yang besar, serta kemampuan untuk membaca hasil beberapa individu secara bersamaan. Menggunakan NGS, genom bakteri dapat diurutkan dalam sekali running. Sebelum Next Generation Sequencing muncul, peneliti telah mengenal Sanger Sequencing, sebagai teknologi pembacaan urutan DNA yang dikembangkan pada tahun 1900-an serta masih digunakan sampai saat ini secara ekstensif dan belum tergantikan untuk proses sequencing DNA target secara cepat dan akurat. Saat ini, Sanger sequencing masih digunakan untuk memvalidasi data NGS. Instrumen Sekuensing Sanger modern menggunakan elektroforesis otomatis berbasis kapiler, yang biasanya menganalisis 8-96 reaksi sekuensing secara bersamaan. Sistem Sequencing Generasi Berikutnya telah diperkenalkan dalam dekade terakhir yang memungkinkan untuk reaksi sekuensing paralel secara masif. Sistem ini mampu menganalisis jutaan atau bahkan miliaran reaksi sekuensing di saat yang sama.
Keterbatasan utama dari metode Sanger Sequencing adalah bahwa metode ini hanya dapat mengurutkan jumlah sekuen DNA yang sangat sedikit serta biaya per basanya sangat tinggi. Perkembangan zaman serta terjadinya perubahan pada makhluk hidup yang begitu kompleks menuntut para peneliti untuk melihat hubungan perubahan urutan genom secara luas untuk melihat pengaruhnya terhadap perubahan tersebut. Oleh karena itu, diperlukan pembacaan urutan genom dari sejumlah besar individu maupun organisme lain untuk diagnosis pengobatan ataupun mencari solusi terhadap masalah yang dihadapi oleh manusia saat ini. Hal ini mendorong kebutuhan akan teknologi yang memiliki input source yang tinggi dengan biaya rendah untuk menghasilkan informasi sebanyak-banyaknya. Selanjutnya, perkembangan teknologi dimasa yang akan datang akan memenuhi kebutuhan data yang sangat besar dengan biaya yang rendah serta memiliki waktu pengerjaan yang lebih cepat.
Selama hampir empat dekade, metode Sanger Sequencing dianggap sebagai standar utama karena tidak ada perkembangan berarti dalaam teknik pembacaan urutan DNA selama bertahun-tahun. Tetapi dalam 15 tahun terakhir, terjadi perubahan yang sangat besar dalam perkembangan teknologi sekuensing. Metode pembacaan urutan DNA yang diterima secara luas yaitu Sanger Sequencing, mencakup generasi pertama yang dikembangkan bersama dengan metode Maxam Gilbert. Metode Sanger Sequencing telah menjadi metode terbaik dalam hal pembacaan urutan DNA karena presisi, ketahanan, dan kemudahan penggunaannya.
Platform teknologi generasi kedua adalah platform yang paling banyak digunakan. Tetapi keterbatasan utama dari mereka adalah terjadinya bias karena langkah amplifikasi PCR. Sebaliknya, teknologi sekuensing generasi ketiga tidak memerlukan langkah amplifikasi dan mampu mengurutkan molekul DNA tunggal secara real time. Platform ini memiliki kemampuan untuk menyediakan single run dengan biaya yang sangat rendah serta membuat persiapan sampel menjadi lebih mudah. Selanjutnya, platform generasi ketiga menghasilkan pembacaan yang umumnya lebih panjang sekitar beberapa kilobase, yang menyelesaikan masalah perakitan pembacaan.
NGS merupakan metode dengan input source yang tinggi, umumnya menunjukkan teknologi yang memungkinkan jutaan reaksi pengurutan secara paralel. Metode ini tidak membutuhkan pemisahan secara fisik atau menggunakan tube yang terpisah secara parsial. Oleh karena itu, ribuan juta reaksi yang berbeda dapat terjadi secara bersamaan, karena adanya penurunan secara ekstrim terhadap input tenaga kerja jika dibandingkan dengan metode konvensional, maka biaya produksi menjadi lebih murah. Langkah umum dalam pembacaan urutan DNA menggunakan NGS adalah (1) persiapan pustaka (fragmentasi genom secara acak, ligasi dengan adaptor yang sesuai), (2) amplifikasi pustaka, dan (3) pembacaan urutan DNA dengan pendekatan yang berbeda. Setidaknya, empat tahapan wajib dilakukan dalam analisis sekuen nukleotida menggunakan platform NGS yaitu (1) pemanggilan basa (base calling) pasca sekuensing, (2) penjajaran dan penggabungan sekuen (assembly), (3) anotasi sekuen (annotation), dan (4) integrasi data bioinformatika menjadi data biologis (data integration).
REFERENSI
- Gupta N., Verma V.K. (2019) Next-Generation Sequencing and Its Application: Empowering in Public Health Beyond Reality. In: Arora P. (eds) Microbial Technology for the Welfare of Society. Microorganisms for Sustainability, vol 17. Springer, Singapore.
