Polymerase Chain Reaction (Amplifikasi DNA)

Dari seluruh kemajuan dalam bidang biologi molekuler modern, polymerase chain reaction (PCR) merupakan salah satu temuan yang paling berguna saat ini. PCR menjadi salah satu temuan yang mampu memperbanyak urutan DNA yang berbeda, dimulai dari DNA dengan jumlah yang sangat kecil, untuk menghasilkan salinan identik DNA dalam jumlah yang sangat besar sehingga cukup untuk dianalisis lebih lanjut. PCR cukup sensitif untuk mengamplifikasi DNA dari satu sel untuk menghasilkan jumlah yang cukup untuk dianalisis. Selain itu, PCR saat ini juga dapat menambah, menghapus, dan memodifikasi DNA. Meskipun penggunaan PCR membutuhkan pengetahuan tentang urutan DNA target terlebih dahulu, berbagai metode pengembangan PCR telah ditemukan untuk mengatasi masalah ini. Tidak heran jika saat ini PCR telah terlibat dalam setiap aplikasi dibidang biologi molekuler dan bioteknologi, baik dasar maupun terapan. Hal ini juga termasuk analisis dalam memanipulasi DNA, menciptakan hewan dan tanaman transgenik, aplikasi dalam bidang forensik, diagnosis medis, penerapan terapi gen, serta analisis DNA yang terdapat dalam lingkungan. PCR juga telah dimodifikasi untuk menentukan jumlah mRNA yang terdapat pada satu jaringan atau organisme berbeda, yang memberikan informasi tentang lingkungan seluler dan gen apa saja yang diekspresikan oleh organisme di alam untuk dapat beradaptasi dengan perubahan yang terjadi.

Fundamental PCR

PCR telah merevolusi bidang biologi karena kemampuannya untuk memproses DNA dalam jumlah yang kecil dan mengamplifikasikannya dalam jumlah yang dapat dianalisis. Sebelum adanya temuan PCR, satu-satunya cara untuk mengamplifikasi DNA adalah dengan memanfaatkan bakteri menggunakan metode kloning untuk memperbanyak salinan DNA. Metode perbanyakan DNA menggunakan bakteri membutuhkan waktu yang cukup lama serta melibatkan plasmid atau Vektor Untuk memindahkan sepotong DNA ke dalam sistem materi genetik bakteri, menumbuhkan bakteri dalam jumlah yang besar, dan memurnikan fragmen DNA yang berasal dari bakteri dengan materi genetik yang membawa gen target. PCR memungkinkan perbanyakan sekuen DNA spesifik dalam jumlah yang besar serta lebih mudah proses pemurniannya tanpa perlu mentransfer DNA ke dalam bakteri untuk membuat salinannya. Enzim DNA polimerase digunakan untuk membuat salinan DNA dari DNA sumber yang sudah ada sebelumnya. Setiap DNA yang baru disintesis, menjadi cetakan untuk menghasilkan DNA yang baru sehingga tercipta reaksi berantai yang menciptakan salinan DNA secara eksponensial. PCR sebenarnya hanya memperbanyak wilayah yang telah dipilih atau urutan DNA target dalam sampel DNA kompleks yang ditentukan oleh dua potong kecil DNA beruntai tunggal yang disebut dengan primer. Primer dalam PCR merupakan kunci untuk memperkuat target yang akan di amplifikasi dari sampel yang kompleks. Bahkan kita dapat mengidentifikasi DNA tertentu dari sampel DNA yang diperoleh dari lingkungan seperti tanah atau air yang mungkin berisi jutaan fragmen DNA yang berbeda dari berbagai makhluk hidup yang menghuni lingkungan tersebut. Oleh karena itu, untuk mengidentifikasi DNA target maka dibutuhkan pengetahuan tentang urutan DNA target tersebut sehingga dapat menentukan urutan DNA primer yang dibutuhkan. Saat ini telah banyak organisme yang seluruh genomnya telah dibaca urutannya sehingga informasi tersebut dapat digunakan untuk menentukan urutan primer  dari sampel organisme tertentu. Saat ini informasi tentang jinom sangat mudah untuk ditemukan, terutama dengan adanya gene bank seperti NCBI  atau National Center for biotechnology information. Secara ringkas, kan PCR dapat dijelaskan  urutannya mulai dari preparasi sampel DNA yang memiliki daerah target yang dilanjutkan dengan pemanasan hingga rantai ganda menjadi rantai tunggal. Setelah menjadi rantai tunggal suhu kemudian diturunkan agar DNA primer dapat menempel di wilayah target. Akhirnya, DNA polimerase membuat salinan dari wilayah yang telah ditandai oleh primer sehingga DNA target akan diamplifikasi (Gambar 1).

Gambar 1. Selama PCR, dua primer menyatu dengan sekuens komplementer di kedua ujung sekuens target pada sepotong DNA sampel yang didenaturasi. DNA polimerase mensintesis untai komplementer DNA dari primer, menghasilkan dua untai DNA baru. Dalam siklus selanjutnya, molekul DNA yang baru, didenaturasi, primer di annealing, dan DNA polimerase menyalin daerah target, untuk menghasilkan banyak salinan dari urutan target asli.

Langkah pertama dalam penggunaan PCR adalah mencampur komponen atau bahan-bahan berikut dalam satu tabung: 

1. Molekul DNA asli atau DNA target. Target mungkin merupakan bagian dari sampel DNA yang kompleks dengan kandungan genom dari organisme yang berbeda ada tetapi dapat juga berupa denah sederhana yang sebelumnya telah diperkuat dengan PCR.
2. Dua primer PCR diperlukan untuk memulai sintesis DNA. DNA primer merupakan potongan pendek DNA untai tunggal yang yang melengkapi urutan di kedua ujung segmen dari DNA target. Primer PCR dibuat melalui sintesis kimia DNA dengan memanipulasi asam nukleat.
3. DNA polimerase diperlukan untuk produksi salinan DNA S spesial melibatkan beberapa langkah dengan suhu yang tinggi sehingga DNA polimerase yang dibutuhkan adalah DNA polimerase yang tahan panas. DNA polimerase biasanya diambil dari bakteri termofilik yang hidup pada lingkungan dengan suhu hingga 90 derajat Celcius atau lebih tinggi. Bakteri yang sering digunakan sebagai sumber DNA polimerase yaitu DNA termos aquaticus sehingga enzim yang dihasilkannya sering disebut dengan enzim taq polimerase. Saat ini telah banyak spesies bakteri termofilik yang diidentifikasi yang mampu memberikan enzim polimerase yang lebih baik untuk membuat salinan urutan DNA target selama proses PCR.
4. Suplai nukleotida atau nukleotida blok yang dibutuhkan oleh DNA polimerase untuk membuat salinan DNA yang baru. Komponen ini dipasok dalam bentuk deoxynucleoside trifosfat (dNTPs). 
5. Buffer yang mengandung konsentrasi ion dan buffer PH yang sesuai untuk memastikan proses reaksi berjalan optimal.

Langkah kedua dalam proses PCR adalah menempatkan tabung yang berisi komponen PCR ke dalam mesin khusus yang disebut dengan PCR machine atau thermocycle (Gambar 2) yang mampu mengubah suhu tabung reaksi fisika dengan cepat dan akurat. Mesin thermocycle mampu mengubah suhu dari ketinggian 95 derajat Celcius hingga terendah mencapai 4 derajat Celcius. Umumnya reaksi PCR akan melalui 20-40 siklus dengan tiga jenis suhu berbeda di setiap siklus. Setiap siklus terdiri dari suhu untuk denaturasi, suhu annealing, dan suhu extension atau pemanjangan.

Gambar 2. Mesin PCR atau Thermocycler di program untuk mengubah temperatur dengan sangat cepat. Blok panas yang umumnya digunakan dalam proses ini mampu mengubah suhu dari 95 derajat celcius pada proses denaturasi, 60 derajat celcius pada proses annealing, dan kembali naik ke suhu 72 derajat celcius pada tahap elongasi hanya dalam waktu beberapa detik. Proses ini juga berlulang hingga 30-40 kali siklus pada setiap proses PCR.

Siklus PCR

Pada tahun 1983 Kary Mullis membayangkan sebuah siklus berulang yang mensintesis DNA yang nantinya akan menjadi kunci ditemukannya PCR. Pada siklus PCR, terdapat tiga langkah dasar atau fluktuasi suhu pada setiap siklusnya. Pada tahapan denaturasi, sampel DNA diubah dari DNA rantai ganda menjadi DNA rantai Tunggal dengan perlakuan pemanasan hingga 95 derajat Celcius. Pemberian suhu panas akan memutuskan ikatan hidrogen yang menahan 2 basa nitrogen yang komplementer. Denaturasi reaksi PCR standar berlangsung sekitar 15 hingga 30 detik bahkan ada yang berlangsung hingga 1 menit lebih. Pada tahapan kedua yang disebut dengan tahapan annealing, suhu diturunkan menjadi sekitar 60 derajat Celcius sehingga memungkinkan primer DNA untuk menempel pada sekuen komplementer atau sekuen target pada sampel DNA. Suhu ini dipertahankan selama kurang lebih 15 hingga 60 detik, dan sangat bergantung pada panjang primer. Semakin panjang primer yang digunakan maka umumnya Semakin spesifik penggunaan primer tersebut. Primer dapat berukuran 10 basa hingga 30 basa nitrogen. Temperature annealing cukup rendah untuk memungkinkan bahasa primer berikatan dengan hidrogen pada DNA target dan dihitung berdasarkan urutan DNA target dan primer (Gambar 3).

Gambar 3. Tahapan pertama dan kedua dari PCR yaitu proses Denaturasi dan Annealing, dimana digunakan suhu 95 derajat celcius untuk memutus ikatan hidrogen DNA sehingga DNA menjadi ratai tunggal. Ketika suhu diturunkan ke 60 derajat celcius, maka primer akan menempel pada sekuen target. Primer PCR menempel dengan posisi anti-paralel terhadap DNA target. 

Pada tahapan selanjutnya disebut dengan elongasi atau extension, dimana suhu dinaikkan ke suhu optimal untuk jenis DNA polimerase termostabil yang digunakan dalam percobaan, biasanya sekitar 72 sampai 75 derajat Celsius. Pada suhu optimalnya, enzim DNA polimerase menggunakan kumpulannukleotida untuk memperpanjang primer yang sebelumnya telah menempel pada DNA target untuk menciptakan DNA komplementer yang baru. Waktu extension sangat bergantung pada panjangnya DNA target. Semakin panjang target, semakin banyak waktu yang dibutuhkan DNA polimerase untuk membuat salinan lengkapnya. Biasanya 1 menit untuk 1000 pasang bahasa sudah cukup. Sintesis DNA berlangsung dari 5′ Menjadi 3′ untuk kedua untai baru karena DNA polimerase menambahkan nukleotida komplementer yang masuk ke dalam gugus 3′ hidroksil primer. Proses Ini menghasilkan dua untai baru DNA beruntai Ganda (Gambar 4). Setelah untai baru dihasilkan, perlu kita sadari bahwa DNA untai baru tidak sepanjang DNA template. DNA untai baru akan menjadi template asli yang sesuai dengan urutan DNA target. Secara teori, PCR menggandakan jumlah DNA sekuat target di dalam sampel, tetapi faktor lain dapat mengurangi efisiensi reaksi ini.

Gambar 4. Setelah primer menempel pada template, temperatur ditingkatkan pada suhu optimal yang dibutuhkan oleh enzim DNA polymerase untuk bekerja, berkisar 72 derajat ceicius. DNA polymerase akan mensintesis DNA komplementer menggunakan Nukleotida untuk membentuk DNA baru dengan memanfaatkan ujung 3' dari primer sebagai starting point. Proses ekstension akan berlanjut hingga ujung DNA pada tahap pertama proses PCR.

Pada siklus kedua PCR, tahapan denaturasi, annealing, dan extension akan di ulang terus menerus hingga 30-40 siklus. Proses ini akan menghasilkan 4 bagian DNA untai ganda. Meskipun panjang DNA template nya bervariasi, seluruhnya memiliki DNA untai ganda pada wilayah target. Selama proses PCR, pada awalnya dibentuk 2 untai ganda pertama sesuai dengan urutan target yang diinginkan. Kedua untai tersebut akan menjadi template yang akan mengalami proses PCR selanjutnya. DNA template yang yang berasal dari DNA awal seiring banyaknya siklus, jumlahnya akan semakin sedikit dibandingkan dengan DNA template yang berasal dari hasil PCR, sehingga sebagian besar salinan akhir dari hasil PCR adalah urutan target beruntai ganda (Gambar 5). Salinan PCR akhir disebut dengan amplikon PCR atau juga hanya disebut dengan produk PCR. Reaksi PCR khas memiliki 30-40 siklus yang diikuti dengan perpanjangan waktu selama 5 menit menggunakan suhu extension. Terkadang untuk menjaga suhu DNA tetap stabil setelah proses PCR, maka digunakanlah suhu 4 derajat Celcius sebagai suhu Post extension selama 10 menit.

Gambar 5. Dua untai DNA yang diproduksi dari siklus pertama kemudian akan mengalamai denaturasi,  annealing, dan ekstension. Hal ini menunjukkan bahwa produk PCR akan menjadi template pada tahapan selanjutnya. Proses PCR menggunakan produk PCR sebagai template membutuhkan waktu yang lebih sedikit dibandingkan dengan proses PCR menggunakan DNA template original.