Polymerase Chain Reaction (Amplifikasi DNA)

Mencegah Salah Mengartikan

Salah satu masalah PCR adalah ketika annealing primer PCR menempek ke urutan DNA diluar target. Dalam beberapa kasus, salah mengartikan dapat mengamplifikasi DNA non-target, tetapi ukuran amplikon PCR nya jarang berukuran sama dengan DNA target yang sebenarnya. Biasanya, menaikkan suhu annealing dapat menyelesaikan masalah tersebut, tetapi dalam beberapa kasus lain, menaikkan suhu annealing tidak cukup. Dalam beberapa kasus, salah mengartikan terjadi selama reaksi. Hot Start PCR adalah varian PCR yang bisa mengurangi amplifikasi spesifik pada suhu yang lebih rendah dari suhu di siklus PCR. Gagasan kuncinya adalah mencegah aktivitas Taq polimerase pada suhu rendah. Beberapa pendekatan berbeda telah digunakan untuk memblokir taq polimerase dengan modifikasi yang dapat dibalik. Pendekatan lain dengan menghambat DNA polimerase dengan antibodi atau memblokir protein yang dilepaskan pada suhu tinggi. Antibodi atau protein pemblokiran melekat pada situs aktif Taq polimerase sehingga tidak dapat mensintesis DNA. Karena protein dan antibodi tidak stabil pada suhu tinggi, denaturasi awal pada suhu tinggi di siklus pertama PCR menghancurkan protein atau antibodi tersebut, sehingga Taq polimerase yang tetap akan berfungsi penuh.

Degenerasi Primer PCR

Untuk membuat DNA primer PCR, beberapa informasi terkait urutan target diperlukan, setidaknya pada ujung urutan target. Ketika hanya urutan parsial yang tersedia, strategi untuk mengamplifikasi urutan target adalah membuat degenerasi primer. Sebagai contoh, katakanlah urutan gen dari satu organisme diketahui, dan gen yang sesuai dari organisme lain tidak diketahui. Jika dua organisme terkait, urutan DNA mereka untuk gen tertentu cenderung mirip, meskipun jarang identik. Kode DNA untuk daerah protein yang memiliki fungsi yang sama biasanya memiliki kode yang dipertahankan (conservation), oleh karena itu, degradasi primer dapat dirancang. Primer dirancang untuk melengkapi sekuens DNA yang dipertahankan (conservation), dan di mana urutan DNA tidak dipertahankan, maka primer dibuat yang memiliki campuran dari semua yang mungkin di posisi tertentu. Meskipun campuran nukleotida ditambahkan, setiap primer individu hanya memiliki satu dari empat basis yang mungkin, dan oleh karena itu, degenerasi primer mewakili campuran primer individu yang berbeda. Satu atau lebih primer dalam campuran ini akan mengenali DNA gen yang diminati. Jika, katakanlah, 18 dari 20 cocok dengan template, primer akan bekerja dengan baik. Banyak segmen DNA telah diamplifikasi dengan sukses oleh PCR menggunakan data urutan dari kerabat dekat organisme target.

Gambar 8. Degenerasi Primer dapat dirancang berdasarkan urutan asam amino pendek dari protein. Karena banyak asam amino dikodekan oleh beberapa kodon alternatif, urutan pengkodean DNA yang disimpulkan dapat menjadi ambigu. Misalnya, tirosin asam amino dikodekan oleh TAC atau TAT. Oleh karena itu, basis ketiga bersifat ambigu, dan ketika primer disintesis dengan campuran 50:50, C dan T akan dimasukkan pada posisi ini. Mudah-mudahan, salah satu primer ini akan memiliki basis komplementer yang cukup menempel ke urutan DNA target yang sesuai dengan gen untuk protein.

Selain itu, degenerasi primer dapat dirancang berdasarkan urutan protein yang dipertahankan. Jika urutan asam amino dari protein diketahui, informasi tersebut dapat digunakan untuk merancang primer. Kesulitan yang dihadapi saat mengubah urutan asam amino menjadi urutan DNA adalah memutuskan mana dari kemungkinan kodon yang akan digunakan dalam DNA target yang akan diamplifikasi. Seperti sebelumnya, PCR akan dilakukan dengan campuran primer yang berbeda. Sebagian besar primer yang berbeda tidak akan cukup komplementer untuk mengenali urutan target, tetapi campuran harus berisi satu primer yang memiliki urutan yang tepat untuk mencocokkan target.