Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Elektroforesis (Electrophoresis)

Polymerase Chain reaction (PCR) adalah teknik amplifikasi sekuens DNA target spesifik secara in vitro. PCR berdasarkan pada aktivitas DNA polimerase. Amplifikasi PCR dapat mengubah sedikit molekul asam nukleat target spesifik menjadi mikrogram DNA (Degen et al., 2006). Prinsip kerja PCR adalah reaksi berulang yang dilakukan oleh polimerase yaitu enzim yang mampu merangkai DNA building block menjadi untai molekular yang panjang.Selain itu dibutuhkan pula nukleotida yang mengandung empat basa nitrogen dan primer (Turner, 2003).

Komponen yang dibutuhkan dalam PCR adalah primer forward dan primer reverse, DNA template, dNTP4 (A, T, G, C), MgSO4, 10x Taq buffer, Taq DNA polymerase, SDW (Sterilized Distillate Water). Primer merupakan dua oligonukleotida yang akan mengapit dan menetapkan sekuens target yang akan diamplifikasi. Primer akan menghibridisasi untai DNA yang berlawanan untuk menyediakan titik inisiasi sintesis untai DNA yang baru dan reaksi ini dikatalisis oleh Taq DNA Polimerase. Menurut Degen et al., (2006), sintesis PCR melibatkan tiga tahap, antara lain denaturasi, annealing, dan ekstensi. PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatusuhu tertentu untuk memberikan waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) degnan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20-40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short “target” product) akan meningkat secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-target (long product) akan meningkat secara linier (Newton and Graham, 1994).

Penggunaan PCR memiliki kelebihan yaitu dalam ketepatan setiap proses dalam tahapan amplifikasi, amplifikasi dapat dilakukan secara manual tanpa mesin termocycle tetapi akan memudahkan dalam penelitian menggunakan mesin PCR lebih cepat dan hasil akan sesuai dengan yang di inginkan, akan tetapi membutuhkan pengaturan waktu optimasi yang sesuai dengan sampel yang digunakan agar tidak merusak sampel yang kita masukkan. Tahap yang menentukan keberhasilan teknik PCR adalah tahap denaturasi yang merupakan awal dari amplifikasi, jika tidak terjadi denaturasi makan proses selanjutkan akan mengalami kesalahan, baik kesalahan penempelan primer sampai kesalahan amplifikasi targer yang diinginkan.

Gambar. Skema Proses PCR (Sumber: Passarge, Eberhard, 2007)

Teknik PCR dapat didayagunakan untuk memfasilitasi analisis gen walaupun terkadang dimodifikasi dengan tambahan teknik molekular lainnya. Selain itu telah dikembangkan banyak sekali aplikasi praktis, sebagai contoh teknik dan aplikasi PCR adalah kloning hasil PCR, sekuensing hasil PCR, kajian evolusi molekular, deteksi mutasi, penyakit genetik, kajian forensik, dan masih banyak lagi. Dengan demikian penemuan dan manfaat teknik PCR ini berdampak sangat luas terhadap kemajuan sains dan teknologi secara umum (Handoyo and Rudiretna, 2000).

ELEKTROFORESIS

Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan molekul yang menggunakan medan listrik (elektro) sebagai penggerak molekul dari matriks penyangga berpori (foresis). Metode ini sangat umum digunakan untuk memisahkan molekul yang bermuatan atau dibuat bermuatan (Fatchiyah, 2011). Teknik ini dapat digunakan untuk memanfaatkan muatan listrik yang ada pada molekul misalnya DNA yang bersifat negatif. Molekul yang dapat dipisahkan antara lain DNA, RNA, atau protein. Jika suatu molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarosa, kemudian dialiri aurs listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Yuwono, T., 2005).

Elektroforesis DNA umumnya menggunakan metode elektroforesis gel agarosa (Karp, 2008). Elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk menganalisis fragmen-fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi. Fragmen molekul DNA yang telah dipotong-potong dapat ditentukan ukurannya dengan cara membuat gel agarosa, yaitu bahan semi-padat berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan melarutkannya dalam suatu buffer. Agar dapat larut dengan baik, pelarutannya dibantu dengan pemanasan hingga gel agarosa dalam keadaan cair sehingga mudah dituang ke atas lempeng, dan sebelum mendingin dibuat sumuran dengan menggunakan perspex menyerupai sisir yang ditancapkan pada salah satu ujung gel yang masih cair. Sehingga ketika gel memadat, terbentuklah sumuran-sumuran kecil. Kedalam sumuran inilah nantinya molekul DNA dimasukkan (Yuwono, T., 2005).

Agarosa merupakan polisakarida yang terdiri dari unit agarobiosa. Konsentrasi agarosa yang biasa digunakan antara 1-3%. Ukuran pori gel bergantung pada konsentrasi agarose, semakin tinggi konsentrasi agarosa maka semakin kecil ukuran pori. Sebaliknya, semakin rendah konsentrasi agarosa maka semakin besar ukuran pori. Agarosa juga mengandung sulfat, semakin rendah konsentrasi sulfat maka semakin murni agarosa. Keuntungan menggunakan agarosa adalah agarosa leleh pada suhu yang rendah (62-65°) (Wilson & Walker, 2010).

Gambar. Tahapan Elektroforesis. A) Pemasangan sisir pada cetakan gel agarosa B) Menuangkan larutan agarosa yang cair setelah pemanasan C) setelah permukaan gel padat, sisir diangkat D) setelah ditambahkan dengan larutan TBE, masukkan DNA sampel pada setiap sumuran E) menghidupkan mesin elektroforesis dengan waktu, set voltase dan arah migrasi yang telah ditetapkan F) hasil dari elektroforesis G) hasil elektroforesis setelah diamati dengan UV illuminator (Sumber: Hartwell, et. al., 2011)

Poliakrilamid terbentuk dari polimerisasi monomer akrilamid dengan adanya N,N’-metilen-bisakrilamid. Monomer akrilamid terpolimerisasi pada kepala ke ekor membentuk rantai. Konsentrasi gel akrilamid yang rendah memiliki ukuran pori yang besar sedangkan konsentrasi gel akrilamid yang tinngu memiliki ukuran pori yang kecil. Konsentrasi gel akrilamid yang rendah juga digunakan untuk pemisahan DNA (Wilson & Walker, 2010). Hasil dari elektroforesis dapat diamati dengan sinar ultraviolet, yang nantinya akan tampak seperti pita-pita pada gel. Pita-pita tersebut adalah molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesis.

Teknik elektroforesis DNA sudah berkembang sehingga analisis molekul DNA tidak hanya dapat dilakukan dengan prinsip elektroforesis liniear. Bebeapa teknik yang sudah dikembangkan misalnya teknik pulse field gel electrophoresis (PFGE), orthogonal field alternation gel electrophoresis (OFAGE), transverse alternating field eletrophoresis (TAFE), dan lain-lain (Yuwono, T., 2005)

REFERENSI

• Brenner, S., Miller, J. H. 2001. Encyclopedia of Genetics. MRC Laboratory of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge. Academic Press
• Campbell, A. Neil., et. al. 2008. Biologi Edisi 8, Jilid I. Penerbit Erlangga. Jakarta
• Clark, D.P. & N.J. Pazdernik. 2009. Biotechnology Applying the Genetic Revolution.Academic Press. New York
• Degen, H., A. Deufel, D. Eisel, S. Grunewald-Janho, & J. Keesey. 2006. PCR Application Manual. Third Edition. Roche Diagnotics GmbH, Mannheim. Germany
• Dolphin, W. D. 2008. Biological investigations. New York : The McGraw-Hill Companies, Inc.
• Fatchiyah, Arumingtyas, E. L., Widyarti, S., Rahayu, S. 2011. Biologi Molekular, Prinsip Dasar Analisis. Penerbit Erlangga. Jakarta
• Handoyo, D., Rudiretna, A. 2000. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Pusat Studi Bioteknologi. Universitas Surabaya. Unitas, Vol. 9, No. 1, 17-29
• Holme, D. J. & Hazel P. 1998. Analytical biochemistry .England : Pearson Education Limited
• Jose, J. and R. Usha. 2000. Extraction of Germiniviral DNA from a highly mucilaginous Plant (Abelmoschus esculentus). Plant Mol. Biol. Rep. 18: 349-355.
• Karp, Gerald. 2008. Cell and molecular biology. New York : John Willey & Sons, Inc.
• Khosravinia, H. & Ramesha, K. P.2007. Influence of EDTA and magnesium on DNA extraction from blood samples and specificity of polymerase chain reaction. African Journal of Biotechnology Vol. 6 (3), pp. 184-187
• Maloy, S. R., John E. C. Jr., David F. 1994. Microbial genetics. London : Jones & Bartlett Pub.
• Marks, D. B., Allan D. M., Colleen M. S. 2004. Basic Medical Biochemistry.
• Newton, C.R. and A. Graham. 1994. PCR. UK: Bios Scientific Publisher.
• Passarge, E., 2007. Color Atlas of Genetics, 3^rd edition Revised and Updated. Germany. Institute of Human Genetics, University Hospital Essen. Thieme.
• Reece, Richard J. 2004. Analysis of Genes and Genomes. John Wiley & Sons Ltd: England.
• Sumner, T. 2003. Chromosome Organization and Function. Blackwell Publishing.
• Surzycki, S. 2000. Basic techniques in molecular biology. Germany : Springer-Verlag Berlin Heidelberg
• Switzer. 1999. Experimental biochemistry. Oxford : Blackwell Scientific Pub.
• Wilson, K. & John M. W. 1994.Principles and Techniques of Practical Biochemistry.UK : Cambridge University Press
• Yuwono, T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta. Erlangga.