Materi Genetik dan Isolasi DNA

Materi Genetik

Setiap sel yang hidup pasti mengandung asam nukleat yaitu berupa Deoksiribonucleat Acid dan (DNA) dan Ribonucleat Acid (RNA). Kedua molekul ini merupakan polimer dari nukleotida yang berperan penting untuk mempertahankan sebagai pembawa informasi genetik. Informasi genetik yang mengatur segala metabolisme dan bersifat herediter (gen) terletak pada molekul yang disebut DNA (deoxyribobucleotide acid) (Maloy, et al., 1994). Molekul DNA membawa informasi hereditas dari sel (Fatchiyah, et.al., 2011). Molekul DNA berfungsi sebagai materi genetik dalam sel hidup. Berfungsi dalam proses reproduksi, salinan karakteristik sel induk berupa DNA akan diteruskan ke generasi berikutnya. DNA berisi informasi yang diperlukan dalam membentuk organisme yang baru (Brenner and Miller, 2001). Materi genetik sangat penting untuk mempertahankan kelangsungan kehidupan dari makhluk hidup dengan mempertahankan kesamaan sifatnya dari informasi yang sama. Asam nukleat adalah suatu polimer nukleotida yang berperan dalam penyimpanan serta pemindahan informasi genetik (Yuwono, 2005). Komponen DNA terdiri dari dua jenis Basa Nukleotida berupa purin dan primidin, gula deoksiribosa, dan gugus fosfat yang dihubungkan dengan struktur kimia. Komponen ini menentukan struktur tiga dimensi dari DNA (Passarge, Eberhard, 2007).

Gambar. A) Basa Nitrogen Purin dan Pirimidin B) Rantai Nukleotida (Sumber: Passarge, Eberhard, 2007)

DNA terdiri dari struktur kimia yang berulang dimana terdapat gugus fosfat yang terkait dengan gula deoksiribosa untuk membentuk struktur dasar dari molekul ini. Pada setiap gugus gula, terdapat tambahan gugus kimia yang dikenal dengan basa nitrogen yang memiliki 4 tipe yaitu adenin (A), timin (T), guanin (G), dan sitosin (C). kombinasi dari fosfat, gula dan basa nitrogen disebut dengan nukleotida. Sebuah kromosom dapat mengandung lebih dari 100 juta nukleotida dan dapat dijelaskan oleh urutan rantai tunggal DNA (Brenner and Miller, 2001). Rantai nukleotida dibentuk oleh gabungan antara gugus gula pada satu nukleotida dengan gugus fosfat yang terikat pada gula dari nukleoida lainnya. Gugus fosfat pada posisi ujung 5’ pada atom karbon nomor 5 dari satu gula membentuk ikatan dengan gugus hidroksil pada ujung 3’ pada atom karbon nomor 3 dari gula berikutnya dengan membentuk ikatan fosfodiester (Passarge, E., 2007).

Gambar. Struktur Untai Ganda DNA (Sumber: Campbell, 2008)

Pada tahun 1953, James Watson dan Francis Crick, berdasarkan pada data eksperimen dari Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins, menemukan bahwa dua buah rantai DNA berpasangan dalam struktur untai ganda (Double Helix) (Brenner and Miller, 2001). Untai ganda DNA tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang berpilin. Kedua rantai mempunyai orientasi yang berlawanan (anti paralel), dimana rantai yang satu memiliki orientasi dari ujung 5’ ke ujung 3’, sedangkan rantai yang lain berorientasi dari ujung 3’ ke ujung 5’. Kedua rantai tersebut erikatan dengan adanya ikatan hidrogen antara basa adenine (A) dengan timin (T), dan antara guanin (G) dan sitosin (C). Ikatan A-T memiliki dua ikatan hidrogen sedangkan antara G-C memiliki tiga ikatan hidrogen sehingga ikatan G-C lebih kuat (Yuwono, T., 2005) Menurut hukum Chargaff, jumlah residu A pada suatu DNA sama dengan jumlah residu T, dan jumlah residu G sama dengan jumlah residu C, sehingga jumlah basa purin sama dengan jumlah basa pirimidin.

Organisasi DNA didalam sel membentuk kromosom. Pada prokariot seperti E. Coli, kromosom membentuk gulungan DNA tunggal berbentuk sirkular tertutup. DNA tersebut dikemas pada suatu tempat di dalam sel yang dinamakan nukleoid dimana konsentrasi DNA bisa sangat tinggi. Pada nukleoid ini juga terdapat semua protein yang berhubungan dengan DNA seperti enzim polimerase, represor dan lain sebagainya. Protein yang paling banyak dijumpai adalah HU, yang mengikat DNA secara nonspesifik dalam arti tidak tergantung pada sekuen tertentu dan sering dikatakan sebagai protein mirip histon. Selain bahan genetik utama, pada prokariot sering juga dijumpai bahan genetik tambahan (extra chromosomal) yang disebut sebagai plasmid. Plasmid pada prokariot berupa olekul DNA untai ganda dengan struktur melingkar. Plasmid umumnya membawa gen ketahanan terhadap antibiotik (Yuwono, T., 2005).

Berbeda dengan DNA prokariot yang berbentuk sirkuler tertutup, DNA eukariot merupakan mokelul linier yang sangat panjang. Panjang DNA eukariot didalam nukleus jauh melebihi ukuran nukleus itu sendiri. Oleh karenanya, agar dapat dikemas, DNA harus dikemas sedemikian mungkin. Pengemasan DNA dilakukan melalui sejumlah tingkatan organisasi kromosom. Tingkatan pertama yaitu lilitan DNA disekeliling sumbu protein sehingga membentuk struktur nukleosom. Pengemasan terjadi dengan cara pelilitan DNA disekeliling sumbu nukleosom yang berupakan oktamer protein basa berukuran kecil yang disebut sumbu histom. Protein histon bersifat basa atau bermuatan positif karena banyak mengandung asam amino arginin dan lisin. Ada empat macam histon penyusun nukleosom yaitu H2A, H2B, H3, dan H4, serta satu macam protein non histon yaitu H1 yang letaknya tidak disumbu nukleosom, melainkan dibagian tepi nukleosom. Dengan adanya molekul H1, ukuran nukleosom menjadi lebih besar yang biasa disebut kromatosom. Pengepakan terakhir dari DNA adalah dalam bentuk kromatin. Kromatin terbentuk dalam keadaan terkondensasi (terlipat dengan erat) dan diperpanjang. Kromosom akan terlihat dengan jelas pada fase metafase (Passarge, E., 2007).

Gambar. Model Pengepakan DNA pada Kromatin (Sumber: Passarge, Eberhard, 2007)

ISOLASI DNA

Isolasi DNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam proses rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar dari isolasi total DNA dari jaringan adalah memecah dan mengeksraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri dari DNA, RNA dan substansi dasar lainnya. (Faatih, M., 2009). Pada dasarnya, metode isolasi DNA terdiri dari tahapan penghancuran (lisis) sel, ekstraksi DNA dan presipitasi DNA (Dolphin, 2008). Isolasi asam nukleat bertujuan mendapatkan asam nukleat yang diinginkan secara murni. Menurut sumner (2003) tahap isolasi DNA antara lain yaitu dengan memecahkan dinding sel untuk mengeluarkan isi sel, melisiskan membran sel agar DNA larut dalam buffer, melindungi DNA dari nuklease endogenus, meminimalisir pemotongan DNA, dan meminimalisir degradasi DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, membran sel harus dihancurkan.

DNA berkualitas tinggi yang akan didapat dalam suatu ekstraksi merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler terutama dalam analisis DNA. Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang umum yang digunakan dalam ekstraksi DNA tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol (Jose and Usha, 2000). Mengeluarkan DNA dari dalam sel memiliki teknik yang berbeda-beda sesuai dengan jenis sel dan struktur dari sel. Untuk isolasi DNA bakteri, enzim lysozyme digunakan untuk mencerna peptidoglikan. Untuk isolasi DNA tumbuhan, dinding sel dihancurkan dengan blender dan dilanjutkan dengan enzim yang akan memotong polimer dinding sel menjadi monomer. Sedangkan untuk isolasi DNA hewan, enzim digunakan untuk mendegradasi jaringan penghubung dan pemisahan komponen intraseluler dilakukan ketika komponen intraseluler keluar dari dalam sel. Pemisahan ini dapat dilakukan dengan sentrifugasi atau ekstraksi kimiawi. Sentrifugasi akan memisahkan komponen berdasarkan ukuran sedangkan ekstraksi kimiawi dilakukan denga menggunakan fenol untuk memisahkan protein dari DNA (Clark & Pazdernik, 2009).

Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Surzycki, 2000).

DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi (Karp, 2008). Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga terkontaminasi oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan cara pemberian RNAse (Clark, 2009). Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi. Pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi (Switzer, 1999).

REFERENSI

• Brenner, S., Miller, J. H. 2001. Encyclopedia of Genetics. MRC Laboratory of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge. Academic Press
• Campbell, A. Neil., et. al. 2008. Biologi Edisi 8, Jilid I. Penerbit Erlangga. Jakarta
• Clark, D.P. & N.J. Pazdernik. 2009. Biotechnology Applying the Genetic Revolution.Academic Press. New York
• Degen, H., A. Deufel, D. Eisel, S. Grunewald-Janho, & J. Keesey. 2006. PCR Application Manual. Third Edition. Roche Diagnotics GmbH, Mannheim. Germany
• Dolphin, W. D. 2008. Biological investigations. New York : The McGraw-Hill Companies, Inc.
• Fatchiyah, Arumingtyas, E. L., Widyarti, S., Rahayu, S. 2011. Biologi Molekular, Prinsip Dasar Analisis. Penerbit Erlangga. Jakarta
• Faatih, M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurusan Pendidikan Biologi FKIP, Universitas Muhammadiyah Surakarta. Jurnal Penelitian Sains dan Teknologi, Vol. 10, No. 1, 2009:61-67.
• Giacomazzi, S., Lerol, F., Joffraud, J.J., 2005. Comparison of three methods of DNA extraction from cold-smoked salmon and impact of physical treatments. Journal of Applied Microbiology 98, 1230–1238.
• Handoyo, D., Rudiretna, A. 2000. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Pusat Studi Bioteknologi. Universitas Surabaya. Unitas, Vol. 9, No. 1, 17-29
• Hartwell, L. H., Hood, L., Goldberg, M. L., Reynolds, A. E., Silver, L. M. 2011. Genetics, From Genes to Genomes. Fourth Edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York.
• Holme, D. J. & Hazel P. 1998. Analytical biochemistry .England : Pearson Education Limited
• Jose, J. and R. Usha. 2000. Extraction of Germiniviral DNA from a highly mucilaginous Plant (Abelmoschus esculentus). Plant Mol. Biol. Rep. 18: 349-355.
• Karp, Gerald. 2008. Cell and molecular biology. New York : John Willey & Sons, Inc.
• Khosravinia, H. & Ramesha, K. P.2007. Influence of EDTA and magnesium on DNA extraction from blood samples and specificity of polymerase chain reaction. African Journal of Biotechnology Vol. 6 (3), pp. 184-187
• Maloy, S. R., John E. C. Jr., David F. 1994. Microbial genetics. London : Jones & Bartlett Pub.
• Marks, D. B., Allan D. M., Colleen M. S. 2004. Basic Medical Biochemistry.
• Newton, C.R. and A. Graham. 1994. PCR. UK: Bios Scientific Publisher.
• Passarge, E., 2007. Color Atlas of Genetics, 3^rd edition Revised and Updated. Germany. Institute of Human Genetics, University Hospital Essen. Thieme.
• Reece, Richard J. 2004. Analysis of Genes and Genomes. John Wiley & Sons Ltd: England.
• Sumner, T. 2003. Chromosome Organization and Function. Blackwell Publishing.
• Surzycki, S. 2000. Basic techniques in molecular biology. Germany : Springer-Verlag Berlin Heidelberg
• Switzer. 1999. Experimental biochemistry. Oxford : Blackwell Scientific Pub.
• Wilson, K. & John M. W. 1994.Principles and Techniques of Practical Biochemistry.UK : Cambridge University Press
• Yuwono, T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta. Erlangga.