Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom merupakan metode yang berguna untuk memisahkan senyawa dalam suatu campuran. Teknik yang digunakan pada kromatografi kolom ialah kolom kaca diisi dengan adsorben (silika gel, alumina, atau kemasan fase terbalik C18) yang digunakan untuk pemurnian sejumlah besar (miligram ke gram) campuran produk reaksi. Adsorben yang digunakan bervariasi, tergantung pada jenis pemisahan yang akan dilakukan.

Adsorben juga sering digunakan untuk menganalisis campuran dengan kromatografi lapis tipis sebelum menggunakan kromatografi kolom. Misalnya, jika kondisi yang sesuai dengan menggunakan pelat KLT silika gel ditemukan, maka gel silika harus digunakan sebagai adsorben untuk kromatografi kolom. Pemisahan dengan menggunakan adsorben fase terbalik C18 membutuhkan waktu cukup lama, dikarenakan elusi dari sistem pelarut yang mengandung air umumnya lambat. Jenis pemisahan yang terbaik ialah menggunakan sistem kromatografi tekanan sedang atau tinggi (MPLC atau HPLC). Tetapi, pembahasan ini hanya akan berfokus pada pemisahan yang dilakukan dengan menggunakan silika gel atau alumina.

Pengemasan Kolom Kromatografi Skala Mikro

Sebelum pengujian dilakukan, kolom kaca harus dikemas dengan adsorben yang sesuai dan pelarut yang sesuai juga. Metode pengepakan kolom, terdiri dari 2 yaitu, pengepakan basah dan pengepakan kering. Pengepakan basah dapat menjadi berantakan, tetapi teknik ini bekerja setiap saat dan lebih disukai untuk mengemas kolom gel silika. Sedangkan pengepakan kering sering mengakibatkan pembentukan gelembung udara yang sulit dihilangkan. Ketika hal tersebut terjadi, kolom harus dikemas ulang. Namun apabila adsorben yang digunakan ialah alumina, metode yang lebih disukai adalah pengepakan kering, karena pengepakan basah dengan alumina memerlukan pembuatan bubur adsorben yang sulit untuk dituangkan.

Pengujian menggunakan kromatografi kolom perlu dilakukan dengan menggunakan eluen gradien. Hal ini menunjukkan bahwa polaritas sistem pelarut mungkin perlu dirubah selama kromatografi, sehingga senyawa nonpolar dan polar dapat dielusi dari kolom. Cara menentukan hal tersebut perlu dilakukan ialah adanya analisis campuran dengan Kromatografi Lapis Tipis. Jika senyawa yang akan dipisahkan memiliki nilai Rf yang sangat berbeda, maka diperlukan lebih dari satu sistem pelarut untuk mengelusi kedua senyawa yang memadai. Jika kromatografi menggunakan eluen gradien, maka perlu mengemas silika gel atau kolom alumina menggunakan pelarut yang paling tidak polar dalam gradien.

Bahan yang diperlukan

1. Eluent (pelarut)
2. Adsorben (mesh silika gel, fisher)
3. Glass wool
4. Kolom kaca dengan ground glass atau sambungan berulir di bagian atas dan stopcock di bagian bawah pasir halus
5. Tabung karet kaku atau sumbat karet yang dipasang pada pegangan (misalnya, batang kayu atau kaca).

Menyiapkan kolom dan adsorben

1. Gumpalan kecil glass wool ditempatkan di atas stopcock tertutup di kolom kaca. Caranya dengan mendorong sumbatan glass wool ke bawah pada bagian atas stopcock menggunakan batang panjang. Hal tersebut dilakukan karena kolom kaca yang dibuat khusus untuk kromatografi kolom, atau buret biasa, dapat digunakan sebagai kolom. Jika sumbat terlalu longgar, adsorben akan bocor dan jika sumbat terlalu padat, eluen akan mengalir lambat melalui kolom. Maka perlu meningkatkan waktu yang dibutuhkan untuk melakukan kromatografi kolom.
2. Jepit kolom secara vertikal ke bagian cincin di dalam tudung. Sisakan ruang yang cukup di bagian bawah kolom untuk rak tabung reaksi atau labu.
3. Tambahkan sedikit pasir halus secukupnya untuk menutupi sumbat glass wool, agar tidak terjadi kebocoran adsorben dari kolom.  
4. Tambahkan eluen (yang ingin digunakan) hingga ketinggian < 2,56 cm di atas lapisan pasir dan pastikan stopcock tertutup sebelum menambahkan eluen.
5. Timbang jumlah adsorben yang sesuai ke dalam gelas kimia. Nilai adsorben yang optimal tergantung pada jenis pemisahan dan adsorben yang digunakan. Silika gel ukuran pori 230-400 mesh akan cukup untuk pemisahan kromatografi rutin. Jika perlu, adsorben dapat diaktifkan dengan pemanasan (menghilangkan air) sebelum digunakan. Kemudian, silika gel bersifat asam lemah, sehingga mungkin perlu untuk menonaktifkannya dengan perlakuan dengan amina encer sebelum dan selama pemisahan senyawa basa lemah seperti amina alifatik.

Pengemasan Kolom: Pengepakan basah
6. Tambahkan eluen secukupnya ke sejumlah adsorben yang telah ditimbang sebelumnya untuk membuat bubur yang mudah dituang (5 mL eluen/g adsorben). Gunakan spatula untuk mengaduk bubur. Pastikan semua adsorben basah dan tidak ada gelembung udara di dalam bubur.
7. Tuangkan bubur ke tepi bagian dalam kolom secara perlahan, agar lapisan pasir di bagian bawah kolom tidak bercampur dengan adsorben.
8. Bilas sisi kolom (aliran bubur adsorben) dengan eluen dan biarkan adsorben mengendap.

Pengemasan Kolom alumina: Pengepakan kering
6. Isi kolom setengah dengan eluen yang dipilih.
7. Tambahkan adsorben kering ke kolom dengan perlahan. Sisi kolom diketuk-ketuk dengan tabung karet kaku saat adsorben ditambahkan. Mengetuk sisi kolom akan memastikan bahwa adsorben mengendap di bagian bawah kolom secara merata, tetapi jika adsorben ditambahkan dengan cepat, panas dapat dibebaskan karena adsorben menyerap pelarut. Sehingga pelarut dapat mendidih dan mengakibatkan perubahan komposisi pelarut dari eluen.
8. Pastikan tidak ada gelembung udara atau ratakan pada kolom setelah pengepakan kering. Gelembung udara dapat dihilangkan dengan cara mengetuk sisi kolom dengan tabung karet kaku atau sumbat karet yang dipasang di ujung pegangan sampai naik ke bagian atas lapisan adsorben Jika gelembung udara tidak dapat dihilangkan, kolom harus dikemas ulang.

9. Setelah kolom dikemas, buka keran dan biarkan eluen mengalir melalui kolom ke dalam labu bersih. Jangan biarkan pelarut turun di bawah tingkat atas adsorben. Eluen yang terkumpul dapat digunakan kembali selama kromatografi.
10. Ketuk sisi kolom dengan tabung karet kaku yang nantinya akan menghasilkan pengendapan tambahan dari adsorben dan meninggalkan sejumlah kecil pelarut di tingkat atas adsorben. Tiriskan pelarut ke dalam labu sampai mencapai tingkat atas adsorben. Ketuk kolom lagi dan tiriskan sisa pelarut sampai adsorben terkemas rapat. Mengetuk kolom dapat membantu dalam mengemas adsorban dengan rapat. Teknik ini juga dapat memastikan tingkat atas adsorben (“dasar” kolom) merata.
11. Tambahkan sedikit pasir halus ke bagian atas adsorben (∼0,5 cm). Dengan menggunakan eluen, bilas pasir kering yang menempel di tepi kolom. Ketuk sisi kolom dengan tabung karet kaku atau sumbat karet yang dipasang di ujung pegangan untuk memastikan bahwa lapisan atas pasir rata. Jika adsorben tidak dikemas dengan rapat, maka tingkat atas adsorben dan lapisan atas pasir dapat bercampur. Sehingga akan menghasilkan “garis dasar” yang tidak rata untuk kromatografi, jika hal tersebut terjadi kolom harus dikemas ulang.

Setelah kolom dikemas dengan adsorben dan eluen yang sesuai, selanjutnya  campuran kasar senyawa yang akan dipisahkan dimasukkan ke bagian atas lapisan adsorben, kemudian dialirkan ke bawah melalui kolom. Prosedur dapat dilakukan dengan menggunakan gravitasi untuk menarik pelarut ke bagian bawah kolom atau dengan memaksa pelarut melalui kolom menggunakan teknik yang dikenal sebagai kromatografi flash. Kromatografi skala mikro juga memungkinkan. Seperti halnya Kromatografi Lapis Tipis, setiap senyawa “menempel” pada adsorben secara berbeda. Dengan demikian, campuran dipisahkan sebagai pelarut terelusi melalui kolom. Senyawa individu keluar dari ujung kolom dan dikumpulkan (ditampung) dalam tabung atau labu terpisah, kemudian dianalisis dengan KLT, dan diisolasi. Umumnya, pemurnian >95% dapat dicapai.