Infiltrasi dan Embedding dalam Metode Parafin
Jaringan yang sudah dijernihkan pada tahap sebelumnya harus segera memasuki tahap infiltrasi (infiltrating) dan kemudian tahap penanaman (embedding) Pembahasan pada bagian akan difokuskan terhadap proses infiltrasi dan penanaman dengan metode parafin Namun demikian, pada bagian akhir akan dibahas pula bagaimana kedua tahap ini dilakukan dengan metode yang lain seperti metode celloidin.
Infiltrasi
Infiltrasi adalah tahap yang sangat penting dan kritis, karena tahap ini sangat menentukan kualitas hasil penyayatan (sectioning) Dalam proses ini, medium imbeding diinfiltrasikan ke dalam seluruh bagian jaringan. Jika parafin akan digunakan sebagai medium embeding, maka infiltrasi jaringan dilakukan dengan cara memindahkannya secara berturut-turut ke dalam parafin lembut (soft paraffin) dengan titik leleh 48°C, parafin menengah (medium paraffin) dengan titik leleh 52-54°C, dan terakhir ke dalam parafin keras (hard paraffin), dengan titik leleh 56°C masing masing selama 15 menit. Proses ini dilakukan di dalam oven. Jika laboratorium hanya memiliki satu jenis parafin, maka infiltrasi tetap harus dilakukan seperti dikemukakan di atas, yaitu dengan tiga kali pemindahan, tetapi dengan parafin yang sama jenisnya.
Mengenai jenis parafin, disamping penggolongan seperti di atas, ada pula laboratorium yang menggolongkannya menjadi dua kelompok saja, yaitu parafin lembut dan parafin keras. Berdasarkan penggolongan yang terakhir ini, yang dimaksud dengan parafin lembut adalah parafin yang memiliki titik leleh antara 50-52°C atau 53-55°C, sementara yang parafin keras memiliki titik leleh antara 56-58°C atau 60-68°C Maka sebaiknya di dalam laporan, jika Anda hendak menuliskan jenis parafin yang digunakan sebaiknya harus disertai dengan deskripsi tentang titik felch dari parafin tersebut.
Selama proses infiltrasi ini, temperatur oven harus diusahakan cukup memadai, tetapi tidak boleh terlalu tinggi, untuk mempertahankan parafin tetap dalam keadaan cair Temperatur yang terlalu tinggi akan menyebabkan kerusakan jaringan maupun kerusakan parafin itu sendiri Selanjutnya, selama infiltrasi kita juga harus yakin bahwa parafin benar benar dalam keadaan cair secara sempurna dan tidak cair sebagian saja. Jika parafin tidak cair secara sempurna maka infiltrasi tidak akan pernah berlangsung dengan sempurna, dan sebagai akibatnya, sayatan yang diperoleh pun tidak akan sempurna pula Perlu pula diperhatikan bahwa parafin cair yang disimpan dalam oven (dengan temperatur yang tepat) selama beberapa han atau beberapa minggu akan menginfiltrasi jaringan lebih baik dibanding dengan parafin yang baru saja dicairkan.
Untuk keperluan khusus, ada kalanya jaringan harus dipindah dari medium penjernih ke dalam campuran parafin medium penjernih (11) sebelum melewati seri parafin tiga kali pemindahan di atas. Tetapi harus tetap diingat bahwa suhu parafin dapat menyebabkan pengerasan dan perapuhan jaringan. Maka jangan biarkan jaringan dalam parafin cair lebih dari 15-20 menit. Jaringan dengan komposisi yang renggang, seperti testis, epididymis dan kelenjar ludah mamalia sangat sulit didehidrasi dan diinfiltrasi dengan baik. Untuk jaringan seperti ini, prosedur berikut ini sangat disarankan untuk ditempuh:
- Pindahkan jaringan dari alkohol absolut ke campuran alkohol absolut – minyak cedar (1 : 1), 60 menit;
- Kemudian pindahkan ke minyak cedar, 24 x 60 menit;
- Selanjutnya ke campuran minyak cedar-xilol (1 1), 60 menit;
- Lalu masukkan ke xilol, 60 menit;
- Pindahkan lagi ke xilol yang dijenuhkan dengan parafin (dalam oven) 60 menit;
- Pindahkan (3 kah pindah) ke parafi, dalam oven, masing-masing 15 menit.
- Tanam dengan parafin.
Penanaman (Embedding atau Blocking)
Setelah infiltrasi, jaringan sekarang siap untuk ditanam dalam blok parafin. Tahap penanaman ini disebut juga dengan blocking (membuat blok) Untuk membuat blok diperlukan suatu cetakan (template). Ukuran blok yang terbentuk ditentukan oleh ukuran cetakan yang digunakan.
Cetakan ada yang terdiri dari dua buah logam berbentuk huruf L yang dapat digerakkan sedemikian rupa untuk memperoleh ukuran blok yang dinginkan Jenis kedua adalah cetakan logam yang bisa dirangkai mirip sarang lebah. Cetakan jenis kedua ini kurang fleksibel karena ukuran blok yang akan dibuat sudah tidak bisa lagi diubah. Kedua jenis cetakan logam ini memiliki kelebihan, yaitu dapat membekukan parafin lebih cepat dari bahan lain. Jenis ketiga adalah cetakan yang terbuat dari bahan gelas. Kelemahan cetakan gelas antara lain adalah bentuk dan ukurannya permanen (tidak dapat diubah lagi). Disamping itu sebelum membuat blok dinding bagian dalam dari cetakan harus dilumuri terlebih dahulu dengan gliserin untuk mencegah lengketnya parafi pada dinding gelas. Jenis keempat, jenis yang paling praktis dan murah, adalah cetakan dari bahan kertas yang dibentuk (dilipat) sesuai dengan ukuran yang diinginkan. Disamping praktis dan murah, cetakan jenis ketiga ini memberi peluang bagi teknisi untuk memberi label dengan leluasa pada setiap blok sehingga memudahkan untuk penanganan blok pasca penanaman, bahkan setelah blok disimpan bertahun-tahun. Cetakan kertas dapat pula diganti dengan cetakan aluminium foil, hanya saja retakan ini tidak bisa ditulisi sehingga sulit membuat label identitas dari setiap blok yang dihasilkan. Masih banyak jenis cetakan yang tersedia dewasa ini, seperti cetakan plastik, cetakan aluminium, dan bahkan cetakan pembuatan es yang biasanya terdapat di lemari pendingin (kulkas) bisa digunakan.
Alat kelengkapan minimal yang harus disiapkan untuk pembuatan blok, antara lain adalah cawan petri, gelas arloji syracause, jarum pentul atau jarum suntik, lampu spritus, pinset halus atau tissue lifter. Masing masing alat kelengkapan ini memiliki fungsi khusus, dan harus diletakkan pada tempat yang mudah terjangkau di sekitar tempat pembuatan blok (dekat dengan oven). Sebagian diantaranya (antara lain jarum dan pinset atau tissue lifter) harus dimasukkan ke dalam oven agar temperaturnya persis sama dengan titik leleh parafin.
Langkah pertama pembuatan blok, apa pun jenis cetakan yang digunakan, adalah mengisi cetakan sampai penuh dengan parafin yang sudah dicairkan dalam oven. Bebera saat kemudian, setelah parafin membeku pada keempat permukaannya dan dengan menggunakan forsep yang sudah dipanaskan (biasakan meletakkan alat ini dalam oven), jaringan yang sudah diinfiltrasi (sekarang dalam parafin ke-3) dipindahkan ke dalam blok lalu diorientasikan secepatnya dengan jarum yang juga sudah dipanaskan. Jika ada gelembung udara terperangkap dalam parafin, keluarkan gelembung tersebut dengan cara menusukkan jarum panas. Semua kelengkapan yang bersentuhan dengan blok parafin harus dipanaskan terlebih dahulu untuk mencegah terjadinya pemadatan parafin pada saat manipulasi. Biarkan blok mengeras secara perlahan Pengerasan blok dapat dipercepat dengan cara memasukkannya ke dalam air pada temperatur kamar, tetapi bukan ke dalam air dingin atau air es. Pendinginan yang terlalu ekstrim dan cepat dapat membuat blok menjadi retak dan akan menimbulkan terperangkapnya gelembung udara dalam parafin pada bagian permukaan atas. Sekarang, blok siap untuk disayat.
Orientasi jaringan dalam blok sangat penting artinya Jika blok ngandung jaringan dengan orientasi yang tidak jelas maka maka blok tersebut sebaiknya tidak disayat Tindakan yang paling bijak untuk menangani blok seperti ini adalah mengembalikan blok tersebut ke dalam parafin cair lalu ditanam kembali (reblocking) Pada saat mengatur orientasi jaringan, sebaiknya jaringan diatur sedemikian rupa sehingga terletak lebih dekat ke salah satu bagian ujung dari blok. Posisi jaringan seperti ini akan memudahkan bagi teknisi untuk melakukan penyayatan.
Blok yang dibuat dengan benar dapat disimpan sampai tak terhingga waktunya tanpa merusak blok atau jaringan di dalamnya, tetapi blok tersebut harus dimasukkan ke dalam plastik lalu disegel rapat dan kemudian disimpan ke dalam lemari pendingin dengan temperatur lebih kurang 4°C (bukan ke dalam freezer). Pemanasan berlebih atau pendinginan dan pemanasan secara perulang-ulang dapat merangsang kristalisasi parafin sehingga parafin menjadi rapuh, dan dengan demikian, akan menimbulkan masalah serius pada saat menyayat.
Pemilihan jenis parafin yang akan digunakan untuk menanam jaringan sangat tergantung kepada ketebalan jaringan yang akan dibuat. Jika sayatan yang hendak dibuat relatif tebal, 10 pm atau lebih, sebaiknya digunakan parafin lembut karena jika digunakan parafin keras makan hasil sayatan akan lepas-lepas dan tidak akan pernah membentuk pita. Sayatan demikian akan sangat sulit untuk ditangani Untuk sayatan yang lebih tipis, misalnya 5-7 pm, gunakan parafin dengan titik leleh antara 56-58°C. Untuk sayatan yang lebih tipis lagi, contohnya 5 μm, sebaiknya digunakan parafin yang lebih keras, hasil yang sangat baik sering diperoleh dengan parafin 60-68°C Dengan pilihan seperti ini bentuk ukuran hasil sayatan akan dipertahankan tanpa kompresi yang berlebih.
Pemilihan parafin ini juga tergantung kepada temperatur lingkungan kerja, lingkungan yang panas (seperti daerah tropis) akan memaksa penggunaan parafin yang lebih keras dibanding dengan ling ingan yang dingin (seperti musim dingin di daerah dengan empat musin) Jika suatu laboratorium tidak mampu membeli parafin dengan titik leleh yang bervariasi, maka pilihan terbaik adalah membeli parain dengan titik leleh antara 56-58°C. Semua langkah-langkah infiltrasi dan penanaman dengan parafin yang disarankan di atas dapat pula diadopsi untuk Tissuemat dan Paraplast (embedding medium setara parafin yang semakin populer dewasa ini).
Infiltrasi dan Penanaman dengan Celloidin
Jika celloidin akan diinfiltrasikan, jaringan harus dipindahkan secara berturut-turut dari alkohol absolut ke campuran alkohol absolut eter anhidrous (11), lalu ke celloidin lembut (thin celloidin) kemudian ke celloidin menengah (medium celloidin) dan ke celloidin keras (thick celloidin), masing-masing selama 24 jam Celloidin keras dibuat dengan cara melarutkan satu ons celloidin kering dalam 300 ml campuran alkohol absolut – eter anhidrous (11) Celloidin medium disiapkan dari celloidin keras dengan cara mengencerkannya sampai 50% dengan campuran larutan tersebut di atas, dan seterusnya untuk celloidin lembut. Hati-hati dengan celloidin karena bahan ini, dan juga pelarutnya (yaitu eter), sangat mudah terbakar Dengan demikian bahan ini harus selalu disimpan dalam kontainer yang dapat ditutup dengan rapat dan diletakkan jauh dari sumber api.
Pembuatan blok dengan celoidin dimulai dengan menuangkan celloidin keras kedalam mangkuk cetakan sampai penuh Ambil jaringan dari oven kemudian masukkan ke dalam cetakan berisi celloidin tadi lalu orientasikan sedemikian rupa jaringan dapat disayat dengan arah irisan dikehendaki. Perlu diperhatikan bahwa permukaan atas dari blok di dalam cetakan celloidin adalah satu-satunya tempat di mana penyayatan bisa dilakukan Jadi jika sayatan melintang suatu organ berbentuk tubulus akan dibuat maka salah satu ujung dan organ tersebut harus diorientasikan tepat ke arah dalam. Jika jaringan telah diorientasikan dengan benar, sekarang celloidin dapat dikeraskan dengan cara memasukkan blok (bersama-sama dengan cetakannya) ke dalam kontainer berisi sedikit kloroform. Sesudah itu kontainer harus ditutup. dengan rapat. Adanya uap kloroform akan mengeraskan celloidin dengan cepat. Setelah celloidin mulai mengeras, pindahkan blok ke dalam kontainer berisi kloroform cair sampai blok celloidin mengeras secara menyeluruh. Selanjutnya blok ini harus dijernihkan dengan cara memindahkannya ke dalam campuran alkohol 95%-gliserol (11) dan membiarkannya sampai beberapa hari. Seterlah itu, blok dapat disimpan dalam alkohol 80%.
