Penyayatan (Sectioning) dengan Metode Parafin dan Celloidin

Menghasilkan sayatan yang sempurna adalah idaman setiap teknisi di laboratorium histologi, tak terkecuali dengan mahasiswa yang sedang mengikuti matakuliah mikroteknik Hasil sayatan, apakah akan sempurna atau tidak, dipengaruhi oleh banyak faktor Boleh dikatakan bahwa semua tahap-Tahap yang telah dilalui sebelumnya, contohnya fiksast, dehidrasi dan blocking, sangat mempengaruhi hasil sayatan Jika salah satu dan tahap-tahap tersebut berlangsung tidak sempurna ak kibat kepada tidak sempurnanya hasil sayatan Bahkan, andaikan luruh tahap tersebut telah dilakukan dengan benar, itu masih belum merupakan jaminan untuk memperoleh sayatan yang sempurna IGT peralatan, ketrampilan dan bahkan faktor lingkungan kerja masih sangat berpengaruh.

Metode Parafin

Sebelum disayat, blok parafin terlebih dahulu harus dipangkan (trumming) menjadi berbentuk kubus atau persegi sampai sebagian besar bagian blok parafin yang tidak berguna di sekitar jaringan terbuang. Blok yang sudah dipangkas selanjutnya ditempelkan pada meja mikrotom dung in cara sebagai berikut. Ambil meja mikrotom dan bersihkan dari parafin yang menempel padanya dan letakkan pada mulut botol, dengan cakram meja menghadap ke atas, dengan cara menyelipkan meja mikrotom tersebut pada leher botol Panaskan ujung pisau spatula, pegang pisau tersebut dengan salah satu tangan dan blok parafin pada tangan yang lain, letakkan pisau spatula menyentuh permukaan atas cakram meja dan pada saat yang sama tekan blok parafin dengan kuat di atas pisau spatula, dan akhirnya tarik spatula sambil menekan dengan kuat blok parafin pada permukaan cakram meja mikrotom Jika pekerjaan ini dilakukan dengan cepat dan benar, blok parafi akan tertempel dengan ketat pada permukaan cakram meja mikrotom Sekarang blok siap untuk disayat.

Blok yang sudah tertempel pada meja mikrotom ini disiapkan untuk disayat dengan mikrotom putar (rotary microfome), suatu alat penyayat yang memiliki presisi tinggi. Untuk menyayat meja mikrotorn terlebih dahulu harus dijepitkan pada pemegang objek (object holder) mikrotom. Setelah itu pasang pisau mikrotom pada pegangannya, atur pisau sedemikian sehingga diperoleh kemiringan yang tepat lalu kunes seluruh sekrup dengan ketat Selanjutnya gerakkan pemegang pisau secara perlahan mendekati blok parafin dan atur sedemikian rup sehingga terdapat sedikit ruang kosong (clearance) antara mata pisau dengan blok parafin Posisi blok dalam pemegang blok kemudian disesuaikan dengan membuat mata pisau sebagai acuan.

Dengan menggerakkan roda pengarah mikrotom satu kali putar maka blok akan bergerak maju dan menyeberang mata pisau, dan sebagai hasilnya satu sayatan tipis akan diperoleh dari blok dan hasil sayatan ini akan melekat pada mata pisau Putaran roda berikutnya akan menyayat blok dan menghasilkan sayatan yang lain yang kemudain akan menempel pada hasil sayatan sebelumnya dan menempel pula pada mata pisau dan seterusnya sehingga akan dihasilkan suatu pita hasil sayatan Setelah dihasilkan beberapa sayatan yang membentuk pita, pegang bagian ujung bebas dari pita dengan kuas kecil sambil tetap melanjutkan penyayatan Dengan cara seperti ini pita akan semakin panjang Jika panjang pita sudah memadai (sesuai dengan kebutuhan), hentikan penyayatan lalu dengan tangan kanan ambil pisau parafin atau skalpel (sementara itu tangan kiri tetap memegang kuas yang berhubungan dengan ujung bebas pita) Perlu diperhatikan mikrotom didisain hanya untuk orang normal, bukan untuk orang yang kidal Letakkan pisau atau skalpel di bawah pita, dekat dengan mata pisau (tetapi jangan sampai menyentuh mata pisau), potong pita dengan menggerakkan pisau atau skalpel ke arah atas. Sekarang salah satu ujung pita pada pisau atau skalpel sementara ujung yang lain tetap menempel pada kuas yang dipegang oleh tangan kiri. Dengan kodisi seperti itu, sekarang pita bisa dipindahkan ke atas permukaan baki sayatan atau kotak cardboard yang datar.

Jika pita tambahan masih dibutuhkan dari blok yang sama, ulangi gerakan seperti dijelaskan di atas kemudian letakkan pita hasil sayatan secara berurutan di atas permukaan baki. Dengan cara seperti ini, pita hasil sayatan akan bisa ditempelkan pada slide secara serial atau menempelkan bagian-bagian tertentu dari blok secara secara progresif. Perlu diperhatikan bahwa permukaan atas dari pita akan tampak Yurang mengkilat jika dibandingkan dengan permukaan bawah Pada saat akan meletakkan pita pada baki, dan selanjutnya ketika akan menempelkannya pada permukaan shde, permukaan yang kurang mengkilap ini harus dipertahankan agar tetap menghadap ke atas Hal ini tidak begitu penting ketika menempelkan hasil sayatan individual yang terpisah pisah, tetapi menjadi sedemikain berharga jika kita ingin menempelkannya secara serial. Ketebalan sayatan sebelumnya diset terlebih dahulu pada mikrotom sebelum memulai menyayat Biasanya, untuk metode parafin, ketebalan yang di set pada skala 5-10 um masih memberikan hasil sayatan yang sangat memuaskan, tergantung pada jenis parafin dan kondisi (temperatur) lingkungan kerja.

Kelebihan dan kekurangan metode parafin

Metode parafin adalah metode umum (general purpose) yang paling baik untuk menyayat jaringan yang telah difiksası Metode ini sangat cocok diadopsi untuk produksi slide secara besar-besaran di laboratorium pendidikan, sangat bagus untuk membuatan sayatan serial atau untuk pengamatan dan rekonstruksi struktur mikroskopis. Metode ini memiliki presisi dan akurasi yang sangat tinggi, ketebalan sayatan akan konstan pada ketebalan yang telah diset sebelumnya sepanjang alatnya tidak mengalami kerusakan.

Walau metode parafin dapat digunakan untuk memproduksi sayatan yang banyak secara cepat, tetapi metode ini masih tergolong cukup lambat untuk keperluan pekerjaan pada laboratorium patologi di tempat mana pada umumnya hanya dibutuhkan beberapa sayatan saja. Disamping itu, metode ini mengharuskan jaringan terdedah terhadap panas yang pada hakekatnya harus dihindari jika jaringan ingin dipertahankan tetap dalam struktur idealnya. Jaringan lemak dan jaringan kelenjar tertentu serta berbagai inklusi sel akan menjadi terlalu rapuh jika diproses dengan metode ini akibat adanya panas tadi Selanjutnya, jaringan padat seperti lemak, kartilago, tendon dan jaringan saraf sangat sulit untuk dunfiltrasi dengan parafin Infiltrasi juga sulit dilakukan pada jaringan longgar atau jaringan kelenjar karena jaringan ini biasanya memiliki ruangan di dalam mana udara sering terperangkap Adanya udara ini akan menghambat masuknya parafin.

Ketika menyayat hasil sayatan bisa robek hanya karena gerakan kecil, atau melompat akibat adanya muatan statik pita sayatan atau muatan statik peralatan yang digunakan, atau terbang melayang hanya karena aliran udara (nafas) yang kecil saja. Dengan demikian, penyayatan membutuhkan tempat khusus di mana temperatur, dan dalam beberapa hal juga kelembaban, harus bisa dikontrol dengan baik. Aliran udara pada ruangan harus dieliminast menjadi sekecil mungkin Kondisi statik dapat diatasi dengan cara meng-grounding pisau atau pemegang pisau mikrotom Biasakan meniup dengan nafas blok parafin atau mata pisau dengan kuat sebelum memulai sayatan baru.

Ada beberapa alasan mengapa blok tidak bisa disayat dengan baik, antara lain fiksasi tidak sempurna sehingga menghambat dehidrasi dan infiltrasi, dehidrasi yang tidak tuntas (mungkin karena waktunya tidak memadai atau karena alkohol absolutnya terkontaminasi dengan air). infiltrasi yang tidak memadai (bisa karena infiltrasi tidak mencukupi atau lebih sering karena jaringan masih mengandung air Jika hasil sayatan tidak membentuk pita yang baik kemungkinan disebabkan oleh parafin yang digunakan terlalu keras untuk kondisi temperatur tempat kerja, atau karena pisau yang digunakan sudah tidak tajam lagi.

Metode celloidin

Biasanya blok celloidin disayat dengan mikrotom geser (sliding microtome), di mana komponen yang bergerak ketika penyayatan adalah pisau mikrotom (bukan blok parafin yang mau disayat) pada sudut kemiringan antara 145 sampai 160 derajat. Hasil sayatan tidak melekat satu dengan yang lain sehingga selama penyayatan tidak akan pernah ditemukan pita sayatan, tetapi hanya berupa keping individual yang lepas-lepas. Blok celloidin harus selalu dibasahi dengan alkohol 80%, dan untuk melakukan hal ini sebuah botol penetes alkohol harus dirangkai pada bagian atas instrumen sehingga alkohol bisa menetes tepat pada blok yang akan disayat Mikrotom celloidin, sama seperti mikrotom lainnya, adalah bersifat otomatis dalam mengatur tingkat ketebalan sayatan Ketebalan sayata yang bisa dibuat dengan metode ini berkisar antara 10 sampai 15 μm, Hasil sayatan dapat diambil dari pisau mikrotom dengan kuas kecil kemudian diletakkan pada suatu petridis atau botol bermulut lebar berisi alkohol 80% Di tempat ini sayatan bisa ditahan sampai tak terhingga lamanya atau sampai akan ditempelkan pada slide.

Kelebihan dan kekurangan metode celloidin

Dengan metode ini jaringan yang ditangani tak pernah terdedah terhadap panas Selanjutnya, jaringan padat dan besar dapat dinfiltrast tanpa kesulitan Dengan metode ini temperatur dan kondisi atmosfer ruangan kerja tidak terlalu berpengaruh sehingga penyayatan bisa dilakukan pada sembarang temperatur Hasil sayatan tidak terlalu rapuh sehingga tidak gampang rusak.

Kelemahannya, proses ini benar-benar berlangsung dengan lambat. dibutuhkan waktu beberapa minggu atau bahkan beberapa bulan hanya untuk infiltrasi yang sempurna Walaupun metode ini dapat dimodifikasi untuk mempercepat prosesnya, tetapi hasil infiltrasinya tidak begitu memuaskan Karena sayata selalu dalam bentuk individual, maka dengan metode ini akan sulit untuk membuat sayatan serial Dengan fasilitas yang ada, sayatan yang sangat tipis tidak bisa diperoleh sehingga sering tidak bisa memenuhi kebutuhan Disamping itu, karena sifat elastisitas celloidin, ketebalan sayatan yang diperoleh bisa sangat bervariasi, di mana variasi bisa mencapai 100%, dan ketebalan sayatan yang sudah diset pada mikrotom.

Metode kombinasi celloidin-parafin

Kombinasi kedua metode dibuat untuk menghimpun seluruh kelebihan yang dimiliki oleh masing-masing metode Tetapi metode kombinasi ini bisa diadaptasi dengan baik khususnya pada pembuatan preparat jaringan berukuran kecil yang mengandung lemak, yolk atau minyak, atau untuk pembuatan sayatan jaringan berkhitin invertebrata, seperti telur dan jaringan insekta, cacing dan hydra.

Prosedur: Jaringan yang telah difiksasi selanjutnya didehidrasi dan dunfiltrasi mengikuti prosedur yang sama seperti metode celloidin Dari campuran alkohol absolut eter jaringan dipindahkan ke dalam celloidin yang sangat encer (larutan 1% dalam alkohol dan eter) Celloidin ini selanjutnya diganti secara bertahap dengan larutan celloidin dengan konsentrasi meningkat, sampai 8% Objek selanjutnya ditanam dengan celloidin 8% dalam cetakan yang terbuat dari kertas mengkilap (glazed paper) Setelah objeknya diorientasikan pada posisinya yang benar, celloidin kemudian dikeraskan pertama-tama dengan uap kloroform, dan kemudian dengan kloroform cair Setelah mengeras, blok kemudian bisa dipangkas (trimmed) sampai ukuran dan bentuk yang dunginkan kemudian dibiarkan dalam kloroform untuk jangka waktu tertentu.

Setelah beberapa hari atau minggu dalam bahan penjernih, blok celloidin kemudian ditanam lagi dalam parafin dengan prosedur sebagai berikut Pindahkan blok ke dalam benzine, beberapa kali ganti, masing masing 10 sampai 15 menit setiap kali pindah Dari benzine, blok kemudian dipindah ke parafin cair-tiga kali pindah, masing-masing 20 sampai 30 menit. Blok kemudian ditanam dengan parafin menggunakan cetakan kertas mengkilap, kemudian dinginkan dan keraskan dengan air Blok ini selanjutnya sudah bisa disayat dengan mikrotom putar dengan prosedur atau cara yang sama dengan metode parafin.

Metode Beku

Karena kecepatan prosesing adalah merupakan keuntungan utama darı metode beku (freezing method), maka metode ini sangat umum digunakan di berbagai laboratorium klinis dan patologi Jaringan yang masih segar maupun yang sudah difiksasi bisa disayat dengan metode beku tanpa melewati tahap dehidrasi terlebih dahulu sehingga sangat menghemat penggunaan waktu. Jika waktu memungkinkan, biasanya Jaringan difiksası terlebih dahulu dengan formalin walau hanya beberapa saat saja Malah di berbagai laboratorium rumah sakit, proses fiksasi ini masih dipercepat lagi dengan cara pemanasan formalin selama fiksasi berlangsung. Peralatan utama yang dibutuhkan untuk metode ini adalah mikrotom klinis atau freezing microtome, biasanya dipasangkan di atas rak atau meja, yang terhubungkan dengan tangki karbondioksida (CO₂) Cara penyayatan untuk jaringan segar atau jaringan yang sudah difiksası adalah sama.

Prosedur: Basahi meja mikrotom beku sedemikian rupa, kemudian letakkan blok jaringan yang masih basah dengan formalin di atas meja mikrotom dan bekukan jaringan tersebut sampai mengeras dengan cara mengalirkan CO2 secara ritmis dari tangki yang diatur melalui katup pengontrol aliran Jika blok sudah benar-benar beku, pasangkan pisau mikrotom pada tempatnya dan atur ketebalan sayatan yang diinginkan Jika permukaan blok kelihatan sedikit melumer, mulailah menyayat, dengan sangat hati-hati agar blok (yang mungkin masih sangat keras) tidak merusak mata pisau Faktor utama yang menentukan keberhasilan penyayatan adalah latihan Latihan yang memadai akan menghasilkan perpaduan antara perasaan dan gerakan jari yang sangat serasi. Panas yang berasal dari jari tangan juga akan membantu mempercepat pelembutan jaringan yang akan disayat.

Segera setelah hasil sayatan kelihatan sudah sempurna, sayatan diambil setiap kali penyayatan dengan cara menggesernya dari mata pisau dengan jari tangan Sayatan tersebut kemudian dipindahkan ke dalam baki yang berisi air dengan cara mencelupkan jari yang mengandung hasil sayatan tersebut ke dalamnya. Di dalam air tidak akan melipat tetapi bisa mengapung atau tenggelam ke dasar baki Selanjutnya sayatan dapat di tempelkan pada permukaan slide dan kemudian diwarnai.