Pewarna (Dyes), Pewarnaan (Staining) dan Mounting (Coverslipping)

Berbagai Pewarna Biologis

Di bawah ini dikemukakan beberapa pewarna biologis yang umum digunakan untuk pewarnaan histologi secara rutin.

Hematoksilin (Asam) Ehrlich

Pewarna ini sangat baik untuk mewarnai inti dan biasanya digunakan secara progresif. Jaringan yang sudah diwarnai kemudian dicuci dan didiferensiasi dengan air ledeng Jika digunakan secara regresif, jaringan diwarnai berlebih (overstained), lalu dicuci, dan kemudian didestainasi (penghilangan warna) dengan alkohol 70% yang telah diasamkan sedikit dengan asam nitrat Jika sitoplasma sudah didestainasi secara memadai, proses ini kemudian dihentikan denan mencucinya kembali dengan air ledeng sampai beberapa kali ganti. Komposisi larutan adalah sebagai berikut:

• Hematoksilin, certified 2 g
• Asam asetat glasial 10 ml
• Gliserol 100 ml
• Alkohol absolut 100 ml
• Kalium alum (aluminum kalium sulfat) 10 g
• Akuades 100 ml

Pembuatan larutan dilakukan mengikuti langkah berikut ini. Hancurkan kalium alum dengan mortar kemudian larutkan dalam air dengan bantuan pemanasan Di wadah yang lain, larutkan hematoksilin dalam asam asetat glasial bersama lebih kurang 25 ml alkohol absolut, aduk untuk mempercepat pelarutan. Jika sudah larut, tuang larutan hematoksilin ke dalam suatu labu Erlenmeyer kemudian tambahkan gliserol ke dalamnya sambil digoyang. Sekarang bilas wadah bekas ghserol dengan absolut alkohol yang masih tersisa dan tuangkan bilasan ini ke dalam labu yang mengandung hematoksilin tadı, sambil tetap menggoyang labu tersebut Tambahkan larutan alum yang hangat (atau sedikit panas) ke dalam labu sedikit demi sedikit sambil mengadakan pengadukan (dengan stirer). Pindahkan larutan yang baru disiapkan tersebut ke dalam botol bermulut lebar (botol berbentuk labu lebih baik), tutup mulut botol jangan terlalu ketat) dengan gumpalan kapas yang ditutupi dengan selapis kain kasa, dan letakkan di tempat yang menerima cukup cahaya. Goyang isi botol tiap han untuk mempercepat proses pemeraman (pematangan) larutan, dan proses ini biasanya membutuhkan waktu dua minggu sampai satu bulan atau lebih. Jika larutan sudah berwarna gelap, ganti tutup botol dengan tutup gelas yang rapat kemudian disegel dengan selotip. Tindakan ini diperlukan untuk mencegah terjadinya proses oksidasi lanjutan. Simpan larutan di tempat gelap dan dingin. Beberapa bulan setelah proses pemeraman, larutan pewarna ini masih bisa digunakan. Pada saat akan digunakan, encerkan larutan ini terlebih dahulu dengan akuades sesuai dengan kebutuhan.

Hematein dari Mann

Pewarna ini dibuat seperti membuat hematoksilin Ehrlich di atas kecuali hematoksilin diganti dengan hemateın, yaitu hematoksilin yang sudah mengalami oksidasi. Dengan demikian, larutan pewarna ini tidak membutuhkan tahap pemeraman. Proses pewarnaan sama dengan hematoksilin Ehrlich. Jika digunakan secara progresif, maka pewarna ini akan sangat bagus mewarnai kromatin dan komponen sel yang bersifat basofilik. Dengan cosin sebagai counterstain, pewarna ini dapat digunakan untuk berbagai tujuan histologi.

Hematoksilin Delafield

Ini adalah pewarna yang paling umum digunakan sebagai pewarna regresif Sayatan terlebih dahulu diwarnai secara berlebih lalu dicuci dalam air ledeng dan dibilas dengan akuades Sayatan kemudian didestain dengan alkohol 70% yang diasamkan sedikit dengan asam asetat Jika pewarna telah lepas (seperti yang dunginkan) sayatan kemudian dinetralisasi dan kembali menjadi berwarna lebih gelap dengan alkohol 70% yang ke dalamnya telah ditambahkan terlebih dahulu sedikit ammonium hidroksida

Sebagai alternatif lain, pewarna ini dapat pula digunakan secara progresif dengan perlebih dahulu mengencerkan pewarna dengan akuades (1:10) Setelah terwarna sesuai yang diinginkan, sayatan kemudian dicuci dan duntensifkan warnanya dalam air ledeng, dibilas dengan akuades, lalu dicounterstain dan kemudian didehidrasi. Komposisi bahan dalam pembuatan hematoksilin Delafield adalah sebagai berikut.

• Ammonium alum 30 g
• Larutkan dalam 400 ml akuades dengan bantuan pemanasan
• Hematoksilin, certified 4g
• Larutkan dalam 25-50 ml alkohol absolut

Campurkan kedua larutan di atas dan diamkan terdedah pada cahaya dan udara selama satu minggu sampai 10 hari. Kemudian ke dalam larutan tersebut tambahkan bahan-bahan berikut ini:

• Gliserol 100 ml
• Metil alkohol 100 ml

Biarkan campuran sampai berwarna gelap. Sesudah itu masukkan ke dalam botol dan tutup botolnya secara ketat dan disegel dengan selotip.

Hematoksilin Heidenhain (Iron-Hematoxylin)

Pewarna ini merupakan suatu bahan kontras yang sangat tajam untuk inti dan bagian sitoplasma dari protoplasma Jika tujuan pengematan adalah untuk melihat detail sitologis inti pewarna ini sangat cocok untuk digunakan. Tetapi selain itu, pewarna ini juga bisa digunakan untuk berbagai keperluan khusus lainnya. Untuk meracik pewarna hematoksilin Heidenhain dibutuhkan dua macam larutan, yang satu sama lain tidak boleh dicampurkan.

Larutan 1

• Ammonium fem sulfat 2,5 g;
• Akuades 100 ml;

Larutan 2

• Larutan hematoksilin 10% 5 ml;
• Akuades 100 ml;

Larutan 2 ini harus disiapkan dari larutan hematoksilin yang sudah diperam, dibuat beberapa hari sebelum digunakan dengan cara melarutkan 1 g hematoksilin dalam 10 ml alkohol absolut. Proses pewarnaan sayatan harus mengikuti langkah-langkah berikut ini.

• Rendam sayatan dalam larutan 1 selama 3-6 jam;
• Cuci dengan air ledeng;
• Rendam dalam larutan 2 selama 3-6 jam;
• Cuci dengan air ledeng;
• Diferensiasi dengan larutan 1, dikontrol secara terus-menerus dengan cara mengamatinya dengan mikroskop;
• Cuci beberapa kali ganti dengan air ledeng;
• Dehidrasi;
• Jika pewarna imbangan (counterstain) dibutuhkan, sebaiknya gunakan Orange G;

Eosin Y, certified

Selalu sediakan di laboratorium, sebagai stok, larutan aqueous 5% eosin Y (gunakan water soluble Eosin Y). Pada saat digunakan, ambil 10 ml larutan stok lalu encerkan dengan 90 ml etil alkohol 25%. Pewarna ini sering digunakan sebagai counterstain untuk hematoksilin alum Sebagai counterstain, eosin Y (dan yellowish) akan memberi nuansa warna yang sangat lebar intervalnya. Bahan ini akan mewarnai sitoplasma dan bahan-bahan sitoplasma lain dengan warna mulai dari merah tua sampai merah muda atau oranye tua sampai kuning pucat. Setelah pewarnaan dengan hematoksilin asam Ehrlich dan diferensiasi dengan air, warnai sayatan dengan cosin selama 15 detik sampai satu menit, tergantung jenis jaringannya. Dehidrasi dengan cepat menggunakan alkohol 70, 80, 95% sampai alkohol absolut. Sesudah itu lewatkan melalui campuran alkohol absolut xilol (1:1), kemudian xilol (2 kali ganti), dan akhirnya sayatan ditutup dengan kaca penutup.

Orange G. certified

Sebagai suatu counterstain umum terhadap iron-hematoxylin, bahan ini biasanya digunakan sebagai larutan 1% aqueous (kelarutan Orange G dalam air, pada temperatur 26°C adalah 10,8%). Jaringan dicounterstain selama 5 menit atau lebih (tergantung jenis jaringan), kemudian didehidrasi dengan cepan menggunakan alkohol bertingkat naik Kapasitas pewarnaan dapat ditingkatkan dengan cara menambahkan 2 ml asam asetat glasial untuk setiap akan digunakan. Komposisi larutan adalah sebagai berikut:

• Orange G 1g
• Akuades 100 ml

Beberapa teknisi lebih menyukai Orange G dalam bentuk larutan jenuh dalam alokohol 80% (solubilitas Orange G dalam alkohol adalah 0,22%).

Eosin, Methylene Blue

Bahan ini adalah pewarna dan counterstain rutin dalam laboratorium klinis, dan akan memberi kontras yang sangat bagus dalam jaringan Sayangnya, bahan ini baru akan memberi hasil yang bagus jika sayatan telah difiksasi dalam fiksatif Zenker atau Helly Sebelum pewarnaan, sayatan harus dihidrasi terlebih dahulu dengan cara biasa Warnai sayatan selama 30 menit dalam larutan eosin 5% (aqueous) pada 37°C Bilas secepatnya dengan akuades, kemudian warnai selama 15 menit dengan larutan Unna’s Alkaline Methylene Blue yang diencerkan dengan akuades dengan perbandingan (1 5), lalu bilas secepatnya dengan air Diferensias sayatan dengan etil alkohol 95% sampai warna eosin muncul. Dehidrasi dengan alkohol absolut, lalu lewatkan ke dalam alkohol absolut-xilol (11), xilol (2 kali ganti), kemudian tutup dengan kaca penutup. Larutan Unna’s Alkaline Methylene Blue diracik dari bahan-bahan berikut ini.

• Methylene blue, certified 1g
• Kalium karbonat Akuades 1g
• Akuades 100 ml

Campurkan dan biarkan larutan beberapa minggu. Encerkan larutan dengan akuades (perbandingan 1:5 atau 1:10) pada saat akan digunakan.