Pewarna (Dyes), Pewarnaan (Staining) dan Mounting (Coverslipping)
Proses Pewarnaan dan Mounting
Proses pewarnaan yang hendak dibahas pada bagian ini didasarkan pada penggunaan pewarna rutin hematoksilin-eosin (disingkat HE), back untuk sayatan parafin, sayatan beku maupun untuk sayatan celloidin.
Sayatan Parafin
Karena pewarna yang akan digunakan ini mengandung air, maka sayatan (yang sudah ditempelkan pada slide) harus dihidrasi terlebih dahulu sebelum diwarnai. Hidrasi hanya bisa dilakukan jika parafin yang masih terdapat dalam jaringan dilarutkan terlebih dahulu dalam xilol. Dari xilol ini slide dapat dihidrasi secara bertahap dengan alkohol konsentrasi turun, kemudian diwarnai dan didehidrasi dengan prosedur sebagai berikut.
Prosedur pewarnaan dengan Hematoksilin : Xilol I → Xilol II → Xilol-alkohol absolut (1:1) Alkohol absolut→ 95% → 80% → 70% → 50% → Akuades →Hematoksilin → Air ledeng mengalir (dua kali ganti) → Akuades (2 kali ganti) → Eosin → Alkohol 70% → Alkohol 80% → Alkohol 96% → Xilol I → Xilol II → Menutup. (Catatan: biarkan slide dalam xilol masing 5 menit (atau sampai seluruh parafin larut), dalam alkohol absolut 5 menit, dalam alkohol 95 sampai 50% 10 menit, dalam air 10 menit atau lebih)
Permukaan larutan dalam setiap jara harus diatur sedemikian rupa sehingga persis dapat merendam seluruh sayatan dengan baik Semua larutan dalam coplin jar harus ditutup untuk mencegah penguapan yang dapat mengkontaminasi ruangan tempat kerja. Setiap jar harus dilabel secara memadai untuk menghidari kekeliruan selama pewarnaan. Masukkan 5 slide ke dalam jar berisi xilol I dengan permukaan yang mengandung sayatan mengarah kepada anda. Biarkan selama 5 menit (atau sampai seluruh parafin larut dalam xilol), dan untuk lebih. membersihkan sayatan dari parafin pindahkan ke dalam xilol II untuk 3-5 menit lagi Sesudah itu, dengan menggunakan forceps, pindahkan slide satu persatu ke jar berisi xilol-alkohol absolut (11) Pada saat memindahkan sentuhkan sudut slide yang bebas pada bibir jar sehingga larutan dari slide dapat mengalir kembali ke dalam jar dengan baik. Selalu lakukan pemerasan slide dengan cara seperti ini, sehingga larutan. dari jar yang pertama tidak terlalu banyak bercampur dengan larutan yang ada pada jar berikutnya.
Dari jar berisi xilol-alkohol ini, pindahkan slide ke dalam jar berisi alkohol absolut kemudian ke alkohol 95% dan seterusnya sampai alkohol 50% dan terakhir pada jar berisi akuades. Waktu yang dibutuhkan dalam setiap jar telah ditunjukkan pada kotak prosedur di atas. Urutan pemindahan slide dari satu jar ke jar yang lain harus sama. Ketika waktu hidarsi dalam akuades telah tercapai, tuangkan air dan jar (pada saat menuang pengan slide dengan jari anda sehingga tidak jatuh) dan gantikan dengan pewarna hematoksilin (hematoksilin asam Ehrlich). Biarkan slide dalam hematoksilin selama 2-3 menit, catat waktunya, dan kemudian tuang larutan pewarna ke tempatnya semula (kembali tahan slide dengan jari agar tidak jatuh) Segera alirkan air ledeng ke dalam jar sampai penuh (hati-hati, cucuran air jangan sampai mengenai sayatan), kemudian tuangkan air tersebut dan isi lagi dengan air ledeng untuk kedua kalinya, biarkan air tetap mengalir sampai 5 menit. Air ledeng pertama berfungsi untuk membuang sisa pewarna dari slide, sementara yang kedua bertujuan untuk mendiferensiasi atau ‘membirukan’ pewarna yang terdapat dalam sayatan.
Perlu dicatat bahwa jika air sedikit bersifat basa warna sayatan akan semakin gelap. Jika air tidak cukup basa, air tersebut perlu dibuat menjadi sedikit basa dengan cara menambahkan sedikit lithium karbonat. Selanjutnya bilas slide dengan akuades kemudian biarkan sampai tahap berikutnya dalam akuades kedua. Pada saat menunggu slide berdiferensiasi, kosongkan seluruh jar yang sudah digunakan tadi kemudian isi lagi dengan larutan yang sama untuk setiap jar, kemudian urutkan dengan uratan terbalik dengan urutan jar pada saat hidrasi tadi (lihat kotak prosedur di atas). Ketika mengisi jar, hati-hati air jangan sampai masuk ke dalam jar berisi xilol atau alkohol Ambil jar yang bersih untuk digunakan sebagai wadah untuk cosin.
Pindahkan slide dari akuades ke dalam eosin, biarkan 30 sampai 60 detik (tergantung konsentrasi eosin yang digunakan), lalu pindahkan berturut-turut ke alkohol 70% sampai alkohol absolut, kemudian ke xilol I dan xilol II. Biarkan dalam xilol beberapa menit, tujuannya adalah untuk membuat jaringan menjadi jernih kembali. Sekarang sayatan siap untuk ditutup dengan kaca penutup. Penutupan dilakukan dengan cara sebagai berikut Bentangkan satu kajang kertas filter di atas meja tempat anda bekerja, ambil satu slide dari xilol II kemudian letakkan di atas kertas filter (permukaan yang mengandung jaringan menghadap ke atas) Teteskan satu tetes Canada balsam tepat di atas jaringan sebelum jaringan kering dari xilol Ambil satu kaca penutup di antara jari telunjuk dengan jempol tangan kiri sementara tangan kanan memegang sebuah jarum. Turunkan kaca penutup sampai menyentuh slide dekat jaringan lalu miringkan ke arah kanan dan tahan ujungnya yang lain dengan jarum Turunkan kaca penutup dengan cara menarik ujung jarum secara perlahan Biarkan Canada balsam menyebar secara merata di bawah kaca penutup untuk mendesak gelembung udara dari bawah kaca penutup tersebut. Biarkan slide mengering, jangan lagi disentuh.
Canada balsam harus dibuat setipis mungkin, kaca penutup dapat ditekan (secar perlahan) dengan bagian penghapus dari pensil untuk menipiskan Canada balsam. Pada hari berikutnya, kelebihan Canada balsam dapat dibuang dengan cara mengeriknya dengan skalpel. Bahan penutup (mounting media) sintetik, seperti methyl methacryolate, dapat digunakan dengan cara yang benar-benar sama dengan Canada balsam Tetapi bahan sintetik ini harus digunakan lebih tipis dari Canada balsam karena bahan ini dapat menimbulkan kontraksi yang lebih besar diabnding dengan Canada balsam.
Sayatan Beku
Karena sayatan beku telah didehidrasi dalam alkohol absolut sebelumnya, sayatan ini harus dibawa kembali pada lingkungan berair dengan cara memindahkannya ke dalam alkohol 80% dan kemudian 70% sampai ke akuades Dari akuades sayatan kemudian diwarnai dengan hematoksilin, dicuci dan didiferensiasi dengan air ledeng Dari air ledeng masukkan kembali ke akuades dan warnai lagi dengan cosin (counterstain) Selanjutnya dehidrate secara parsial dengan alkohol 70, 80 sampai 95% lalu jernihkan dengan minyak origanum lalu lewatkan melalui xilol, tutp dengan Canada balsam dan kaca penutup.
Untuk mewarnai beberapa slide sekaligus diperlukan cawan pewarnaan khusus berbentuk persegi Masukkan larutan pewarna ke dalam cawan, di tempat lain susun slide dalam rak slide yang ukurannya bisa masuk ke dalam cawan lalu dimasukkan secara suksesif ke dalam satu seni cawan yang berisi reagen Metode ini mempunyai kelemahan karena dapat memindahkan larutan secara signifikan dari cawan yang satu ke cawan berikutnya.
Mewarnai beberapa slide sekaligus mungkin lebih cocok menggunakan cawan persegi yang mempunyai celah-celah khusus untuk tempat slide Masukkan slide ke dalam cawan dan tuangkan xilol sampai seluruh bagian sayatan terendam Setelah beberapa menit, tuang kembali xilol ke dalam tempatnya semula menggunakan corong sambil tetap menekan ujung slide agar tidak jatuh Larutan akan tertuang melalun salah satu sudut cawan seperti jika kita menuang dari beaker yang berbibir Ganti xilol dengan campuran xilol-alkohol, dan kemudian turun ke alkohol sampai akuades.
Dengan cara pewarnaan seperti ini, yaitu dengan menggunakan satu cawan saja, akan mencegah terjadinya kesalahan seperti yang sering terjadi jika menggunakan banyak cawan. Disamping menggunakan jar persegi, pewarnaan dengan cara ini juga dapat dilakukan dengan menggunakan Coplin jar, tetapi proses menuangkan larutan dari satu tahap ke tahap berikutnya tidak semudah jika kita menggunakan cawan persegi yang dilengkapi dengan rak slide.
Jika mewarnai banyak slide sekaligus, terutama bagi pemula, usahakan agar slide tidak disusun saling memunggungi karena reagen dari larutan pertama akan menempel pada ruangan antar slide karena adanya gaya kapilaritas. Reagen ini akan terbawa masuk ke reagen yang kedua, jika ini terjadi pada dehidrasi maka air akan terbawa masuk ke dalam alkohol absolut Jika masuk ke xilol, molekul air akan terbawa ke xilol dan ini akan menimbulkan kontaminasi xilol yang bisa berakibat buruk pada proses penjernihan post pewarnaan.
Sayatan Celloidin
Setelah penyayatan, sayatan dimasukkan ke dan ditahan dalam alkohol 80% Dengan demikian jika akan dihidrasi kita tinggal memindahkannya ke dalam alkohol 70% dan terakhir dalam akuades. Jika kita ingin mewarnai hanya beberapa slide saja, pindahkan sayatan secara individual dengan mengguanakan section lifter Tarık sayatan dengan menggunakan kuas kecil yang halus, selipkan section lifter di bawahnya pada saat dia terbenam dalam alkohol Dengan cara yang sama. pindahkan sayatan ke dalam akuades, hematoksilin, air ledeng (tiga kali ganti atau lebih), lalu ke akuades, eosin, alkohol 70, 80 dan 95% Jernihkan dalam minyak origanum, lekatkan di atas permukaan slide yang bersih (tak perlu diberi albumen Mayer), keringkan dan tutup. Jika banyak sayatan celloidin hendak diwarnai, dehidrasi dan jernihkan sayatan secara simultan dengan jalan memasukkan syatan ke dalam kantung saringan teh berlubang. Pindahkan sayatan ini secara berurutan yang benar dari satu larutan ke larutan yang lain, dan biarkan kering setiap meninggalkan satu reagen atau larutan.
